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Influência da perda evolutiva do ácido siálico Neu5Gc no repertório global de anticorpos naturais

Título: Influência da perda evolutiva do ácido siálico Neu5Gc no repertório global de anticorpos naturais
Aluno: Philippe Caloba
Orientador(es): 

Todas as nossas células do nosso organismo são decoradas com uma camada de glicanas conhecida como glicocálice. Essas glicanas podem estar ligadas a proteínas ou lipídeos e são majoritariamente terminadas em ácido siálico, um açúcar de nove carbonos que medeia diversas interações proteína-ligante. Glicoproteínas sialiladas de células humanas são terminadas somente pelo ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), enquanto a maioria dos mamíferos contém glicanas terminadas em Neu5Ac e em ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). Os humanos perderam o gene Cmah que codifica a enzima que hidroxila Neu5Ac em Neu5Gc. Uma vez que estudos anteriores demonstraram que a perda de Neu5Gc resulta em um aumento na ativação e funções efetoras de células do sistema imunológico em humanos, buscamos investigar se a perda de Neu5Gc pode estar relacionada com o perfil de autorreatividade de anticorpos naturais (NAbs). Para testar essa hipótese, testamos o soro ou sobrenadantes (SNs) de cultura de linfócitos B peritoneais de camundongos selvagens e camundongos deficientes para a enzima Cmah (Cmah-/-) contra proteínas de extratos de músculo e cérebro de camundongos selvagens e Cmah-/-, através de Western Blot. Nossos dados mostram uma maior ligação de IgM de soro e SN de camundongos Cmah-/- contra ambos os extratos de músculo quando comparados à IgM de camundongos selvagens, demonstrando que a perda de Neu5Gc aumenta o perfil de reatividade de IgM contra diferentes antígenos próprios. Além disso, a ligação dos SNs é diretamente influenciada por estruturas glicanas presentes nas proteínas do músculo, uma vez que a incubação com a enzima peptídeo N-glicosidase F (PNGase-F), que remove completamente N-glicanas, ou com Neuraminidase, que remove somente unidades terminais de ácido siálico, modulou diretamente a ligação da IgM presente nos SNs de camundongos selvagens e Cmah-/-. Tendo em vista que o repertório de anticorpos naturais pode ser modulado pela microbiota intestinal e que dados anteriores do nosso grupo demonstraram diferenças na microbiota intestinal de camundongos selvagens e Cmah-/-, realizamos ensaios de citometria de fluxo para avaliar a antigenicidade de bactérias presentes nas fezes. Nós demonstramos que há um maior percentual de bactérias IgA+ em camundongos selvagens do que em camundongos Cmah-/-, sugerindo que a antigenicidade da microbiota intestinal não é o mecanismo responsável pelo aumento na ligação de IgM. Em seguida, analisamos o efeito da coabitação de camundongos selvagens e Cmah-/-, avaliando a reatividade de IgM sérica dos dias 0, 15 e 30 pós-coabitação contra extratos de músculo. A IgM sérica de camundongos Cmah-/- apresentou um aumento na imunorreatividade a extratos de músculo nos dias 15 e 30 pós-coabitação, enquanto não houve alterações nos camundongos selvagens, sugerindo que a modificação da microbiota intestinal de camundongos Cmah-/- pode modular o seu repertório de anticorpos naturais. Experimentos futuros avaliando a ingestão de Neu5Gc pela dieta são necessários para compreender melhor até que ponto o Neu5Gc pode modular os NAbs. Em conjunto, nossos dados sugerem que a perda evolutiva de Neu5Gc pode ter aumentado a reatividade do repertório de anticorpos naturais em humanos e que a microbiota intestinal apresenta um papel importante neste fenômeno.

Palavras-chave: Neu5Gc, anticorpos naturais, microbiota

Every cell in the body is decorated with a layer of glycans known as the glycocalyx. These glycans are attached to proteins or lipids and their majority are terminated in sialic acid, a nine-carbon sugar that mediates many protein-ligand interactions. Sialylated glycoproteins from human cells terminate only with the N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) isoform of sialic acid, a pattern that differs from the majority of other mammals, whose glycans can also terminate with N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). This is due to the evolutionary loss of the Cmah gene, which encodes the enzyme that hydroxylates Neu5Ac in Neu5Gc. Previous studies have shown that Neu5Gc loss increased activation and effector functions of immune cells in humans, therefore we hypothesize that the absence of Neu5Gc could influence the autoreactivity profile of natural antibodies (NAbs). To test this hypothesis, we blotted serum or peritoneal B cell culture supernatants (SNs) from WT and Cmah-null C57BL/6 mice against WT and Cmah-null mice proteins from muscle and brain extracts. Our data shows increased binding of serum and SN IgM from Cmah-null mice to both WT and Cmah-null mice muscle extracts when compared to IgM from WT mice, suggesting that the absence of Neu5Gc increases IgM reactivity against self-antigens. Moreover, SNs’ binding is directly influenced by glycan strucutures bound to proteins present in the muscle, since peptide N-glycosydase F (PNGase-F), which removes entire N-glycan structures, and Neuraminidase treatment, which removes terminal sialic acid, directly modulated both WT and Cmah-null SNs IgM binding to the muscle. Because the natural antibody repertoire can be modulated by gut microbiota and previous data have shown that WT and Cmah-null mice have differences in their gut microbiota composition, we performed a flow cytometry assay to evaluate the antigenicity of their feces-bound bacteria. We show that bacteria from WT mice have more IgA bound to them when compared to Cmah-null mice, suggesting that the antigenicity of the gut  microbiota is not the mechanism responsible for the increased IgM binding profile we previously saw. Next, we analyzed a WT versus Cmah-null mice co-housing experiment, evaluating binding of serum IgM from 0, 15 and 30 days post co-housing to the muscle extract. Serum IgM from Cmah-null mice showed increased binding to muscle extracts after 15 or 30 days in co-housing, while no changes were seen in WT mice IgM, suggesting that the modulation of Cmah-null mice gut microbiota can modulate their natural antibody repertoire. Further experiments on dietary intake of Neu5Gc are necessary to better comprehend to what extent Neu5Gc can modulate NAbs. Taken together, our data suggest that the evolutionary loss of Neu5Gc might have increased the reactivity of the natural antibody repertoire in humans and that gut microbiota plays an important role on this phenomena.

Keywords: Neu5Gc, natural antibodies, microbiota

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2020

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Análise da progressão tumoral em câncer de cólon de indivíduos diabéticos

Título: Análise da progressão tumoral em câncer de cólon de indivíduos diabéticos
Aluno: Ronan Christian Machado dos Santos
Orientador(es): Profa. Adriane Regina Todeschini

O câncer colorretal (CCR) é o terceiro mais incidente e a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo. Evidências epidemiológicas mostram que indivíduos diagnosticados previamente com diabetes mellitus (DM) apresentam um desenvolvimento mais agressivo em diferentes tipos de câncer quando comparados a pacientes não diabéticos. Além disso, o DM se correlaciona fortemente com a incidência e mortalidade do CCR. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram que a hiperglicemia aumenta a malignidade do tumor através da via biossintética das hexosaminas (VBH) e glicosilação aberrante. Neste trabalho visamos desenvolver um modelo que reproduza fielmente a evolução clínica do CCR sob influência da hiperglicemia que nos permita averiguar se a VBH estabelece um elo de correlação entre DM e CCR. Para a realização deste estudo foram utilizados: camundongos geneticamente modificados para desenvolver CCR de forma espontânea (Apc-CPC WT / ApcCPC Cmah-/- ) tratados ou não com Estreptozotocina (STZ), substância diabetogênica, além de cortes histológicos do cólon de pacientes diabéticos ou não com CCR. Em camundongos APCCPC WT foi observado menor expressão de GFAT1 em tecidos tumorais em relação a tecidos normais adjacentes. Além disso, animais tratados com STZ revelaram uma tendência de aumento nos níveis de O-GlcNAcilação em ambos tecidos, adjacente e tumoral, em relação aos animais controles. Contudo, os animais com mutação em Cmah responderam melhor ao tratamento com STZ e apresentaram visível agravo na formação de pólipos comparado ao modelo WT, revelando maior representatividade do quadro clínico esperado. Além disso, a análise preliminar de amostras de tumores de pacientes não diabéticos revelou que os níveis de GFAT2 diminuem em áreas de menor diferenciação, sugerindo que a transformação maligna leva à redução de GFAT2. Além disso, o tumor de pacientes diabéticos apresentou maior infiltrado inflamatório e margem tumoral mais invasiva, quando comparado a um paciente não diabético de estadiamento similar, consistente com um perfil mais agressivo e infiltrante. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que o diabetes contribui para a malignidade do tumor, alterando a VBH.

Palavras-chave: Adenocarcinoma colorretal; Câncer colorretal; Diabete Melitus; Hiperglicemia; Via Biossintética das Hexosaminas.

Colorectal cancer (CRC) is the third most incident and the second main cause of death worldwide. Robust epidemiological data have shown that diabetic individuals are at higher risk of developing aggressiveness of different types cancer when compared to non-diabetic patients. Furthermore, diabetes mellitus (DM) has a strong correlation with incidence and mortality in CRC. In our previous studies we showed that hyperglycemia increases tumor malignancy and aberrant glycosylation through hexosamine biosynthetic pathway (HBP). Here we aimed to develop a model wthat would more closely represent the clinical evolution of CRC under hyperglycemia conditions, to allow a better understanding of HBP potential link between DM and CRC. We used genetically modified mice that develop spontaneous CRC (Apc-CPC WT / Apc-CPC Cmah -/- ) treated or not with the diabetogenic drug Streptozotocin (STZ) as well as human colon tissue samples from patients with CRC bearing or not DM. We saw lower expression of GFAT1 in tumoral tissues compared to normal adjacent tissues in Apc-CPC WT mice. In addition, STZ-treated mice revealed a tendence of increased O-GlcNAcylation levels in both adjacent and tumor tissues, in relation to the control group. Interestingly, the APC-CPC Cmah-/- mice had a stronger response to STZ treatment as showed by a notable aggravation in tumor size compared with WT model. These data suggest a better representativeness of ApcCPC Cmah-/- to the clinical aspects seen in human patients. Moreover, preliminary analysis of tumor samples of non-diabetic patients revealed decreased levels of GFAT2 in less differentiated areas, suggesting that malignant transformation could lead to a reduction in GFAT2 expression. In agreement, the tumor of diabetic patients showed a higher inflammatory infiltrate and a more invasive tumor front when compared with non-diabetic patients at the same tumor staging, consistent with a more infiltrating and aggressive behavior. Altogether, our results suggest that DM contributes to the malignancy of colorectal tumors through modulation of HBP activity.

Keywords: Colorectal adenocarcinom; Colorectal cancer; Diabetes Mellitus; Hyperglycemia; Hexosamine Biosynthetic Pathway.

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Caracterização da senescência celular renal em camundongos C57Bl/6 submetidos à sepse

Título: Caracterização da senescência celular renal em camundongos C57Bl/6 submetidos à sepse
Aluno: Rayzza Pessanha da Silva
Orientador(es): Profa. Claudia Farias Benjamim

A sepse é definida como resposta desequilibrada do hospedeiro à infecção acompanhada de disfunção orgânica. Sobreviventes à síndrome podem apresentar comprometimentos tardios como imunossupressão, perda de cognição, alterações cardiovasculares, lesão renal aguda (IRA), dentre outros. Dados prévios do nosso grupo demonstraram que camundongos sépticos que recebem desafio secundário com doses altas de albumina apresentam quadro de fibrose renal e IRA. Os mecanismos subjacentes aos comprometimentos tardios ainda são pouco compreendidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se o quadro de sepse grave induz aumento dos sinais de senescência celular nos rins. Para o estudo foram utilizados camundongos C57BL/6 submetidos ao modelo de ligação e perfuração do ceco (CLP - 9 perfurações / agulha 21G) e subsequente tratamento com antibiótico por 3 dias consecutivos. Os rins foram coletados em 24 horas, 3, 7 e 10 dias após a cirurgia. Observamos que os rins dos animais sépticos apresentavam aumento dos marcadores de fibrose, como PAS e Picrosirius 7 dias após o CLP. Em seguida, observamos aumento de p16INK4a nos rins dos animais sépticos, um marcador de senescência, nos tempos de 7 e 10 dias póssepse, quando comparados com o grupo sham. Outros marcadores como a enzima βgalactosidase e as citocinas IL-1β e IL-6, presentes no fenótipo secretor associado a senescência (SASP), também estavam aumentados em 24 horas, 3, 7 e 10 dias nos animais sépticos em relação ao grupo sham. Avaliamos ainda a autofagia, um mecanismo regulador da senescência, que estava aumentada em 7 e 10 dias. Nós também detectamos aumento de apoptose nos rins dos animais sépticos no dia 10 após a cirurgia, comparado ao grupo sham. Por último, avaliamos a disfunção mitocondrial, sem, no entanto, encontrar diferenças entre os animais CLP e sham no tempo avaliado. Assim, nossos dados mostram que a senescência celular está elevada nos rins de animais sépticos, o que pode estar relacionado com a fibrose renal observada em nosso modelo, provavelmente pela produção de mediadores inflamatórios que compõem o SASP, como TGF-β, IL-6, TNFα e as metaloproteinases. Palavras-chave: sepse; senescência celular; lesão renal aguda; inflamação.

Palavras-chave: Sepse; senescência celular; lesão renal aguda; inflamação.

Sepsis is defined as the host's unbalanced response to infection accompanied by organ dysfunction. Survivors of the syndrome may develop long-term consequences as immunosuppression, cognitive impairment, cardiovascular commitment, acute kidney injury (AKI), and others. Previous data from our group demonstrated that septic mice that receive secondary challenge with high doses of albumin present with renal fibrosis and AKI. The mechanisms associated to late impairments are still poorly understood. Thus, our aim was to evaluate whether severe sepsis induces an increase in cellular senescence parameters in kidneys. We used C57BL/6 mice submitted to the cecum ligation and perforation model (CLP - 9 punctures / 21G needle) followed by antibiotic treatment for 3 consecutive days. Kidneys were collected at 24 hours, 3, 7 and 10 days after surgery. We observed that kidneys of septic animals presented an increase in fibrosis markers, such as PAS and Picrosirius 7 days after CLP. Then, we observed an increase in p16INK4a in septic mice, a senescence marker, at 7 and 10 days after sepsis when compared to sham. Other markers as the enzyme β-galactosidase and cytokines IL-1β and IL-6, present in the senescence-associated secretory phenotype (SASP), were also increased at 24 hours, 3, 7 and 10 days compared to sham. We also evaluated autophagy, a senescence regulating mechanism, which was increased in 7 and 10 days. We also detected increased apoptosis in the kidneys of septic animals on the 10th day after surgery, compared to the sham group. Finally, mitochondrial dysfunction, without, however, finding differences between CLP and sham animals in the evaluated time. Thus, our data show that cell senescence is elevated in the kidneys of septic animals, which may be related to the renal fibrosis observed in our model, probably due to the production of inflammatory mediators by SASP, such as TGF-β, IL-6, TNFα and metalloproteinases. Keywords: sepsis; cell senescence; acute kidney injury; inflammation.

Keywords: Sepsis; cell senescence; acute kidney injury; inflammation.

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Identificação de receptores de alta afinidade contra componentes manosilados da parede celular fúngica

Título: Identificação de receptores de alta afinidade contra componentes manosilados da parede celular fúngica
Aluno: Marina da Silva Ferreira
Orientador(es): Profa. Ana Carolina de Siqueira Couto De Oliveira

As micoses emergiram nas últimas décadas dentre as principais causas de enfermidades humanas. Devido à ausência de especificidade para um determinado hospedeiro, os fungos são capazes de causar doenças em múltiplas espécies. Estes microrganismos interagem com hospedeiros ambientais, como a espécie de ameba de vida livre Acanthamoeba castellanii e macrófagos de diversas espécies, encontrando no interior destes, um ambiente propício para proteção, sobrevivência e disseminação. Nosso grupo descreveu a importância do receptor de manose (MR), identificado na superfície amebóide, como uma das principais vias de ligação fúngica. Na literatura, o receptor de manose também é descrito por sua participação na interação entre fungos e macrófagos. Assim, é possível estabelecer uma relação de similaridade entre amebas e macrófagos, não apenas por compartilharem propriedades de estrutura celular, motilidade, fisiologia, captura por emissão de pseudópodos e fagocitose, mas também pelo semelhante mecanismo de interação com microrganismos, apontando para possível evolução convergente dos receptores envolvidos. Diante disso, investigamos as proteínas de superfície de ambos modelos, afim de encontrar possíveis candidatos à receptores de alta afinidade contra manoproteínas e mananas de parede celular fúngica. Inicialmente, após biotinilação das superfícies de ambos, seus extratos apresentaram perfil proteico variando entre 10-250 KDa. Determinamos a ligação dessas proteínas aos fungos patogênicos Candida albicans, Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum. Confirmamos que os extratos de macrófagos murinos apresentaram maior intensidade de ligação quando comparados aos extratos de A. castellanii, apontando para a maior complexidade proteica daqueles em relação à superfície amebóide durante a interação. Observamos altíssima afinidade dos extratos à manose e mananas. Assim, direcionamos a nossa procura, através da purificação dos extratos protéicos dos fagócitos por cromatografia de afinidade, em coluna de manose e enriquecimento em placa sensibilizada com manose solúvel. E assim, confirmamos por Western blot, a presença desta lectina no extrato. Identificamos nos extratos enriquecidos de A. castellanii proteínas de, aproximadamente, 150 kDa, 75 kDa, 55 kDa e 35 KDa. Já nos enriquecidos de macrófagos murinos foram identificadas proteínas entre 170 e 50 KDa, além de bandas de menores pesos moleculares, em torno de 35KDa. Para determinar a importância desta lectina ligadora de manose na interação, realizamos ensaios de fagocitose, na presença e ausência de manose solúvel como inibidor. Porém encontramos menores porcentagens de inibição nos experimentos com macrófagos, concluindo que, diferentemente das amebas, diversos outros receptores podem participar do mecanismo de interação, de forma compensatória, destacando a importância deste tipo de interação para cada espécie de hospedeiro e a possível diversidade. Em complemento, realizamos ensaios para avaliar a capacidade de eliminação dos fagócitos, em ambas condições. E os resultados mostraram menor número de unidades formadoras de colônias, na presença de manose, em ambos os casos, o que nos leva a concluir que há dependência deste receptor para a interação das células fagocíticas com a superfície fúngica, levando a sua sobrevivência no interior dos fagócitos. Os dados sugerem que, provavelmente, ocorre a evolução e o surgimento de outras vias de interação em hospedeiros superiores. Futuramente, pretendemos realizar a construção, produção e caracterização de lectinas-Fc, utilizando sequências das lectinas ligadoras de manose identificadas, por espectometria de massas, na fusão com a porção Fc efetora de imunoglobulinas murinas. Como manoproteínas e mananas estão presentes universalmente na parede celular fúngica, estas proteínas quiméricas permitiriam o reconhecimento dos fungos por receptores Fc (FcR) presentes na superfície dos fagócitos, promovendo mecanismos de imunidade (inata e celular) e de ação antifúngica.

Palavras-chave: A. castellanii; macrófagos; interação; fungos patogênicos; receptores de manose

Mycoses have emerged in recent decades among the main causes of human diseases. Due to the lack of specificity for a given host, fungi are capable of causing disease in multiple species. These microorganisms interact with environmental hosts, such as the free-living amoeba species Acanthamoeba castellanii and macrophages of different species, finding in their millieu an environment conducive to protection, survival and dissemination. Our group described the importance of the mannose receptor (MR), identified on the amoeboid surface, as one of the main pathways for fungal binding. In the literature, the mannose receptor is also described for its participation in the interaction between fungi and macrophages. Thus, it is possible to establish a similarity relationship between amoebas and macrophages, not only because they share properties of cellular structure, motility, physiology, capture by pseudopod emission and phagocytosis, but also by the similar mechanism of interaction with microorganisms, pointing to possible convergent evolution of the receptors involved. Therefore, we investigated the surface proteins of both models, in order to find possible candidates for high affinity receptors against mannoproteins and fungal cell wall mannans. Initially, after biotinylating the surfaces of both, their extracts showed a protein profile ranging between 10-250 KDa. We determined the binding of these proteins to pathogenic fungi Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Histoplasma capsulatum. We confirm that the extracts of murine macrophages showed greater binding intensity when compared to the extracts of A. castellanii, pointing to a higher protein complexity of those in relation to the amoeboid surface during the interaction. We observed also a high affinity of both extracts to mannose and mannans. Thus, we direct our search, through the purification of protein extracts of phagocytes by affinity chromatography, in a mannose column and enrichment in a sensitized plate with soluble mannose. And so, we confirmed by Western blot, the presence of this lectin in the extract. In A. castellanii enriched extracts we identified proteins of approximately 150 kDa, 75 kDa, 55 kDa and 35 KDa. In the enriched with murine macrophages proteins between 170 and 50 KDa were identified, in addition to bands of lower molecular weights, around 35 KDa. To determine the importance of this mannose-binding lectin in the interaction, we performed phagocytosis assays, in the presence and absence of mannose as inhibitor. However, we found lower percentages of inhibition in the experiments with macrophages, concluding that, unlike amoebae, several other receptors can participate in the interaction mechanism, in a compensatory way, highlighting the importance of this type of interaction for each host species and the possible diversity. In addition, we carry out tests to evaluate the killing capacity of phagocytes, in both conditions. The results showed a smaller number of colony-forming units, in the presence of mannose, in both cases, which leads us to conclude that there is dependence on this receptor for the interaction of phagocytes to the fungal surface and survival in their millieu. The data suggest that, probably, occured the evolution and the appearance of other ways of interaction in superior hosts. In the future, we intend to carry out the construction, production and characterization of Fc lectins, using sequences of mannose-binding lectins identified, by mass spectrometry, in the fusion with the Fc effector portion of murine immunoglobulins. The manoproteins and mannans are universally present in the fungal cell wall, these chimeric proteins would allow the recognition of fungi by Fc receptors (FcR) present on the surface of phagocytes, promoting mechanisms of immunity (innate and cellular) and antifungal action.

Keywords: A. castellanii; macrophages; interaction; pathogenic fungi; mannose receptors.

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Caracterização do camundongo Sv129 como um modelo susceptível à infecção por Leishmania amazonensis: Participação de células Tγδ

Título: Caracterização do camundongo Sv129 como um modelo susceptível à infecção por Leishmania amazonensis: Participação de células Tγδ
Aluno: Julio Souza dos Santos
Orientador(es): Prof. Herbert Leonel de Matos Guedes

As leishmanioses representam um conjunto de doenças negligenciadas que acomete milhares de pessoas anualmente. No Brasil, um dos parasitos mais relevantes é a Leishmania amazonensis, responsável por causar diversas manifestações clínicas, tais como a leishmaniose cutânea difusa. Devido à complexidade de fatores de resistência e susceptibilidade, bem como o papel desconhecido de várias células da imunidade, modelos murinos são necessários para o avanço do conhecimento. Neste trabalho, diferentemente do que era mostrado na literatura para outras cepas murinas, caracterizamos o camundongo Sv129 como um modelo susceptível à infecção por L. amazonensis. Além disso, demonstramos pela primeira vez neste modelo de infecção o papel de células Tyg+ como fundamental para o desenvolvimento da leishmaniose cutânea. Inicialmente, infectamos os camundongos Sv129 no coxim plantar da pata traseira direita com duas cepas de L. amazonensis (MHOM/BR/75/Josefa e MHOM/BR/77/LTB0016) e identificamos o desenvolvimento progressivo de severas lesões, além de alta carga parasitária em ambos os casos. A infecção por L. amazonensis MHOM/BR/75/Josefa induziu altos níveis séricos de anticorpos, como IgG1, IgG2a, IgG2b e IgE séricos, que podem estar diretamente envolvidos na gravidade da doença. Assim como os camundongos BALB/c susceptíveis, detectamos no linfonodo drenante da lesão que os camundongos Sv129 falharam em induzir uma resposta protetora de células T CD4+ e T CD8+ produtoras de IFN-γ. No entanto, analizamos que a infecção por L. amazonensis induziu uma significativa expansão de células Tγδ produtoras de IL-17 em comparação com camundongos BALB/c e C57BL/6. Em seguida, assim como mostrado na literatura para os camundongos BALB/c e C57BL/6, constatamos que existem dois tipos de células T γδ + no linfonodo drenante dos camundongos Sv29 (T γδ + CD3high e T γδ + CD3low). Interessantemente, diferente do que é descrito na literatura, a infeção por L. amazonensis induziu uma relevante expansão de células T γδ + CD3low produtoras de IL-17 que foi favorecida pela falta da sinalização do Interferon do tipo 1. Ao transferirmos células T γδ+ de camundongos infectados para hospedeiros naïve posteriormente infectados L. amazonensis, descobrimos que as células T γδ+ possuem um importante papel na patogênese da leishmaniose cutânea induzida por L. amazonensis na linhagem Sv129, correlacionando com maior lesão e carga parasitária em comparação com os camundongos que não receberam a transferência. Este trabalho identifica que camundongos Sv129 são viáveis para o estudo da leishmaniose cutânea por diferentes cepas de L. amazonensis e que significativamente induzem população de células T γδ+ produtoras de IL-17 que podem estar diretamente associadas a gravidade da doença.

Palavras-chave: Leishmania amazonensis; Leishmaniose cutânea; camundongo Sv129; IgG; células T γδ + CD3low produtoras de IL-17

Leishmaniasis represents a set of neglected diseases that affect thousands of people annually. In Brazil, one of the most relevant parasites is Leishmania amazonensis, responsible for causing several clinical manifestations, such as diffuse cutaneous leishmaniasis. Due to the complexity of resistance and susceptibility factors, as well as the unknown role of many immune cells, murine models are necessary for the advancement of knowledge. In this work, differently from what was shown in the literature for other murine strains, we characterized the Sv129 mouse as a model susceptible to infection by L. amazonensis; in addition, we demonstrated for the first time in this model of infection the role of γδT cells as essential for the development of cutaneous leishmaniasis. Initially, we infected Sv129 in the right hind footpad with two strains of L. amazonensis (MHOM / BR / 75 / Josefa and MHOM / BR / 77 / LTB0016) and we identified the progressive development of several lesions, in addition to a high parasitic load in both cases. Infection with L. amazonensis MHOM / BR / 75 / Josefa induced high serum levels of antibodies, such as serum IgG1, IgG2a, IgG2b and IgE, which may be directly involved in the severity of the disease. Like susceptible BALB/c mice, we analysed in the lesion draining lymph node that Sv129 mice failed to induce a protective response of IFN- γ-producing CD4+ and CD8+ T cells. However, we observed that L. amazonensis infection induced a significant expansion of IL-17-producing γδ T cells compared to BALB/c and C57BL/6 mice. Then, as shown in the literature for BALB/c and C57BL/6 mice, we found that there are two types of γδ T cells in draining lymph nodes in Sv29 mice (CD3high and CD3low). Interestingly, differently from what is shown in the literature, the infection by L. amazonensis induced a relevant expansion of IL-17-producing γδ T cells CD3low, which was favored by the lack of Interferon signaling type 1. When transferring γδ T cells from infected mice to naïve mice subsequently infected by L. amazonensis, we found that γδ T cells play an important role in the pathogenesis of cutaneous leishmaniasis induced by L. amazonensis in Sv129 mice, correlating with greater injury and parasitic burden in compared to mice that did not receive the transfer. This work identifies Sv129 mice that are viable for the study of cutaneous leishmaniasis by different L. amazonensis strains and that induce populations of IL-17 producing γδ T cells that may be affected by the disease.

Keywords: Leishmania amazonensis; Cutaneous leishmaniasis; IgG; Sv129 mice; IL-17 producing T γδ + CD3low cells.

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2019

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Resposta imunitária inata contra o Corynebacterium diphtheriae

Título: Resposta imunitária inata contra o Corynebacterium diphtheriae
Aluno: Vinicius Mendes Vidal
Orientador(es): Prof. Marcelo Torres Bozza

Introdução: A difteria é uma doença infecciosa aguda do trato respiratório superior causada pelo Corynebacterium diphtheriae (Cdi). Além da infecção clássica, o Cdi é capaz de causar infecções invasivas. Apesar da vacinação, os casos de difteria não se extinguiram e os números globais permanecem estáveis. Surtos da doença acontecem frequentemente, atingindo inclusive indivíduos vacinados, e a mortalidade em geral é alta. O potencial epidêmico de diferentes cepas é desconhecido, o que representa um risco de ressurgência da doença. Desde a formulação da vacina, os estudos de difteria são escassos, principalmente em relação a interação do Cdi com o hospedeiro. Objetivo: Descrever os aspectos gerais da resposta imunitária na infecção in vitro e in vivo em camundongos C57BL/6 pelo Cdi, enfatizando o papel dos receptores TLR2 e TLR4. Metodologia: células RAW, pneumócitos A549 e macrófagos oriundos de medula óssea (BMDMs) murina selvagens (WT), Tlr2 -/- e Tlr4 -/- foram infectados in vitro com as amostras de Cdi 27010 e 27012. Após o estímulo, avaliou-se a capacidade de aderência e internalização bacteriana e sua capacidade de induzir óxido nítrico (NO), arginase e citocinas pró-inflamatórias. Animais WT, Tlr2-/- e Tlr4-/- foram infectados via intranasal ou intraperitoneal com a cepa Cdi 27012. Os animais foram acompanhados ao longo de treze dias e avaliados quanto ao peso, carga bacteriana em diferentes compartimentos, bem como em relação a presença de infiltrado inflamatório. Resultados: O Cdi se mostrou capaz de aderir a macrófagos murinos e de induzir a produção de NO, arginase, TNF-α e IL-6 nestas células. A produção de NO e arginase foi dependente da sinalização pelos receptores TLR2 e TLR4, ao passo que a produção das citocinas foi dependente apenas de TLR2. O Cdi se associou em maior quantidade com BMDMs Tlr4-/- em comparação com WT. O Cdi foi capaz de invadir células da linhagem de pneumócitos A549. Experimentos realizados in vivo mostraram que camundongos WT, Tlr2-/- e Tlr4- /- são resistentes à infecção pulmonar com o Cdi 27012, e pouca ou nenhuma resposta inflamatória foi suscitada. Enquanto que, na infecção intraperitoneal, animais Tlr2-/- e Tlr4-/- apresentaram maior perda de peso. Os animais Tlr4-/- foram os que apresentaram maior carga microbiana no peritônio. Observamos a evidente ativação da resposta imunitária e inflamatória, marcadamente baseada em neutrófilos e macrófagos peritoneais pequenos (SPMs). Os receptores TLR2 e TLR4 parecem ser importantes para a tolerância ao dano, mas não essenciais para a resistência à infecção. Conclusões: o Cdi é capaz de ativar macrófagos, induzindo um perfil pró-inflamatório nestas células, mas apesar disso, também induzindo arginase. Ambos os receptores TLR2 e TLR4 parecem ser importantes para o reconhecimento do bacilo diftérico, e implicam na ativação dos macrófagos. Contudo, a ausência individual deles ocasiona fenótipos distintos in vitro e in vivo. Nossos resultados indicam que neutrófilos e macrófagos talvez sejam as populações celulares mais importantes para o controle da infecção pelo Cdi, e apesar dos receptores TLR2 e TLR4 serem importantes para o recrutamento de células, eles não são essenciais para o controle da infecção.

Palavras-chave: Macrófagos;TLR2 e TLR4;Óxido Nítrico;Arginase.;Difteria

Introduction: Diphtheria is an upper respiratory acute infectious disease caused by Corynebacterium diphtheriae (Cdi). Besides classical disease, Cdi is able to cause invasive infections. Despite global immunization, diphtheria is still prevalent. Outbreaks are frequently reported, affecting both vaccinated and non-vaccinated individuals. Mortality rates are customarily high. Infections due to non-toxigenic Cdi and epidemic strains are quite alarming for diphtheria re-emergence. Since vaccine development, studies regarding diphtheria are scarce, especially in relation to the interaction between Cdi and the host. Aim: Describe general aspects regarding the immune response against Cdi infection in vitro and in vivo in C57BL/6 mice, highlighting the role of TLR2 and TLR4. Methods: RAW macrophages, A549 pneumocytes and bone marrow derived macrophages (BMDMs) WT, Tlr2-/- and Tlr4-/-were infected in vitro with Cdi 27010 and 27012. After infection, bacterial adherence and internalization were assessed. The capacity of Cdi to induce nitric oxide (NO), arginase and pro-inflammatory cytokines was also evaluated. Additionally, WT, Tlr2-/- and Tlr4-/-mice were infected with Cdi 27012 either via intranasal or intraperitoneal route. Mice were checked for thirteen days and assessed for body weight changes, bacterial burden in different compartments, and inflammatory cell infiltrate. Results: Cdi was able to adhere to murine macrophage, and induce NO, arginase TNF-α and IL-6 in these cells. NO and arginase production were dependent on TLR2 and TLR4 signalling, whereas cytokine production was only TLR2- dependent. Cdi showed higher association levels with Tlr4-/-BMDMs in compare to wildtype cells. Cdi was able to invade A549 pneumocytes. WT, Tlr2-/- and Tlr4-/-mice were resistant to pulmonary Cdi 27012 infection, displaying little inflammatory response. In contrast, intraperitoneal infection provoked evident immune and inflammatory response, notably due to neutrophil and small peritoneal macrophage (SPM) recruitment. TLR2 and TLR4 seem to be important for damage tolerance, but are essential for resistance to infection. Conclusions: Cdi is able to activate macrophages, inducing a pro-inflammatory profile in these cells, yet inducing arginase as well. Both TLR2 and TLR4 seem to be important for Cdi recognition, which reflects upon macrophage activation. However, TLR2 and TLR4 individual depletion lead to distinct phenotypes in vitro and in vivo. Our results suggest that neutrophils and macrophages might be critical for Cdi control. In spite of TLR2 and TLR4 apparent role for leucocyte recruitment, these receptors are not imperative for disease control.

Keywords: Diphtheria; Macrophage; TLR2 and TLR4; Nitric Oxide; Arginase

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Estudo do líquido cefalorraquidiano sobre a quebra da barreira hematoencefálica durante a mielopatia associada à infecção pelo HTLV-1

Título: Estudo do líquido cefalorraquidiano sobre a quebra da barreira hematoencefálica durante a mielopatia associada à infecção pelo HTLV-1
Aluno: Thais Silva de Oliveira
Orientador(es): Profa. Juliana Echevarria Lima

O vírus linfotrópico para células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da Mielopatia Associada à infecção pelo HTLV-1/Paraparesia Espástica Tropical (MAH/PET). O desenvolvimento de MAH/PET depende da quebra da barreira hematoencefálica (BHE) e da migração de leucócitos para a medula espinhal. A BHE mantém o meio interno do cérebro altamente regulado e a sua quebra facilita a entrada de células e patógenos no sistema nervoso central (SNC). O desenvolvimento de MAH/PET envolve o aumento da expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular, citocinas inflamatórias e metaloproteases. A circulação do líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fenômeno dinâmico e sua regulação é responsável pela homeostase cerebral. Alterações neste fluido são prejudiciais à integridade do tecido cerebral. Assim, o objetivo do nosso trabalho foi estudar as interações entre o LCR de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e o endotélio da microvasculatura cerebral. Para tal, usamos uma linhagem celular microvascular de cerebral humana (HBMEC) cultivada na presença LCR de indivíduos infectados com HTLV-1. A presença de mediadores inflamatórios no LCR foi capaz de comprometer a integridade da barreira hematoencefálica. Nossos resultados demonstraram que o LCR de indivíduos infectados pelo HTLV-1 reduziu a resistência elétrica transendotelial (TEER) da monocamada de células HBMEC após 40 horas. Além disso, aumentou sua permeabilidade. Adicionalmente, o aquecimento do LCR reverteu parcialmente a redução da TEER em células HBMEC, o que não foi observado após ultracentrifugação. Essas alterações ocorrem sem comprometimento da viabilidade celular e sugerem que a quebra da barreira hematoencefálica facilita a migração de células inflamatórias. Mostramos, também, que as células tratadas com o LCR de indivíduos infectados, tanto de portadores assintomáticos quanto de pacientes com MAH/PET, são alteradas em comparação com controles de células cultivadas somente na presença de meio. A análise proteômica dessas células demonstrou perfis proteicos distintos, com aumento de proteínas associadas a processos metabólicos, mostrando que o mestabolismo celular é modulado por componentes do LCR. Além disso, demonstramos que importantes proteínas de citoesqueleto e de adesão célula-célula são moduladas nas HBMECs tratadas com o LCR desses pacientes. Além disso, o LCR destes indivíduos estimulou o aumento de propriedades de adesão endotelial, como a expressão aumentada de CD44, o que permitiria uma maior capacidade de ligação de células inflamatórias ao endotélio. Nossos resultados indicaram que a expressão de pan-caderina foi elevada em HBMECs tratadas com o LCR de indivíduos infectados pelo HTLV-1. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a natureza dos fatores envolvidos na desorganização da monocamada de células endoteliais é de origem proteica, e que o LCR de indivíduos infectados por HTLV-1 está envolvido no desenvolvimento e progressão da MAH/ PET.

Palavras-chave: MAH/PET; hBMEC; BHE; LCR; SNC; TEER

The human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the etiological agent of the Myelopathy Associated with HTLV-1/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP). The development of HAM/TSP depends on the breakdown of the blood-brain barrier (BBB) and the migration of leukocytes to the spinal cord. BBB maintains the internal brain environment highly regulated, and its breakdown facilitates the entry of cells and pathogens into the central nervous system (CNS). The development of MAH/PET involves increased expression of adhesion molecules by the vascular endothelium, inflammatory cytokines and metalloproteases. The circulation of the cerebrospinal fluid (CSF) is a dynamic phenomenon, and its regulation is responsible for cerebral homeostasis. Changes in this fluid are detrimental to the integrity of the brain tissue. Thus, the objective of this study was to evaluate interactions between CSF obtained from HTLV-1-infected individuals and the endothelium of the cerebral microvasculature. Therefore, we used a human cerebral microvascular cell line (HBMEC) treated with CSF from HTLV-1-infected individuals. The presence of inflammatory mediators in CSF is capable of compromising the integrity of the blood-brain barrier. Our results demonstrated that CSF of HTLV-1-infected individuals reduced the transendothelial electrical resistance (TEER) of HBMEC monolayers after 40 hours of incubation and increased its permeability. Additionally, heating of CSF partially reversed the reduction in TEER of HBMECs, in contrast to ultracentrifugation. These changes occured without impairment of cell viability, which suggests that breakdown of the blood-brain barrier may facilitate the migration of inflammatory cells. We also showed that cells treated with CSF from HTLV-1-infected individuals, asymptomatic carriers as well as patients with MAH/PET, are altered when compared to cells maintained only with culture medium. Using proteomic analysis, we showed that these cells have distinct protein profiles, with increase in proteins associated with metabolic traits, showing that cellular metabolism is modulated by components within the CSF. We also showed that important cytoskeletal and cell-cell adhesion proteins are modulated in these cells when treated with CSF from HTLV-1-infected individuals. In addition, CSF from HTLV-1-infected patients increased the adhesive properties of the endothelium, as shown by the enhanced expression of CD44, which can lead to a greater adhesion capacity of inflammatory cells to the endothelium. Our results indicated that pan-cadherin expression was elevated in HBMEC treated with CSF from HTLV-1-infected individuals. In conclusion, our results suggest that the nature of factors promoting the disorganization of endothelial cell monolayer is of protein origin, and that CSF of HTLV-1-infected individuals is involved in the development and progression of HAM/TSP.

Keywords: HAM/TSP; HTLV-1; hBMECs; Blood-Brain-Barrier; CSF; CNS; TEER

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Estratégias de inibição da Glutamina:Frutose-6-fosfato amidotransferase humana (hGFAT)

Título: Estratégias de inibição da Glutamina:Frutose-6-fosfato amidotransferase humana (hGFAT)
Aluno: Daniela Maria dos Santos Lucena
Orientador(es): Profa. Adriane Regina Todeschini

A via biossintética das hexosaminas (VBH) é um dos ramos do metabolismo da glicose que fornece o monossacarídeo ativado uridina difosfato N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc), um sensor metabólico intracelular essencial para a glicosilação. A primeira etapa da VBH é realizada pela enzima glutamina:frutose-6-fosfato-amidotransferase (GFAT). Esta enzima possui dois domínios: glutaminase e isomerase; que catalisam a formação de glicosamina-6-fosfato (GlcN-6P) a partir da frutose-6-fosfato (Fru-6P) e glutamina (Gln). A GFAT é conservada em todos os organismos estudados até o momento, incluindo bactérias, fungos e mamíferos. Os humanos têm três isoformas diferentes de GFAT, denominadas GFAT1, GFAT1Alt e GFAT2, com GFAT1 tendo expressão ubíqua nos tecidos. A GFAT2, por sua vez, compartilha 75% de identidade com a GFAT1 e é expressa principalmente nos tecidos do sistema nervoso central. O interesse na GFAT aumentou nos últimos anos, uma vez que esta proteína tem sido implicada em importantes desordens metabólicas humanas. No câncer, observou-se que a expressação aumentada de GFAT1 é relatada em câncer da mama e da próstata e que a GFAT2 é regulada positivamente no adenocarcinoma pancreático e no câncer do cólon. Portanto, a GFAT foi identificada como um potencial alvo quimioterápico para o câncer. O inibidor comercial da GFAT é o DON (6-diazo-5-oxo-L-norleucina), um análogo de Gln que se liga irreversivelmente ao sítio glutaminase da enzima. Entretanto, não é utilizado na clínica devido à sua não seletividade e citotoxicidade, sendo restrito ao uso na pesquisa. Portanto, é necessário procurar novos potenciais inibidores da GFAT. Nesse trabalho, estudamos estratégias de inibição da GFAT2 humana (GFAT2h) através de potenciais inibidores seletivos. De modo a realizar um amplo rastreio de potenciais inibidores de GFAT, utilizamos as técnicas de modelagem molecular, como docking e virtual screening, para refinar a seleção de protótipos inibitórios e obter insights para futuro refinamento da estrutura. Os principais compostos resultantes da triagem inicial foram testados e avaliados in vitro frente a sua atividade. Depois de expressar e purificar com sucesso a GFAT2 recombinante humana a partir de células de Escherichia coli, a atividade inibitória de uma série de compostos (LASSBio-1799, 1801, 1802, 1805, 1808, 1809, 1821 e 294), selecionados in silico, contra a enzima recombinante foi avaliada pelo ensaio Elson-Morgan, que detecta a quantidade total de GlcN-6P formada. A partir da série LASSBio testada, apenas o LASSBio-1799 e 1801, mostraram uma ligeira atividade inibitória.

Palavras-chave: GFAT; Via das hexosaminas; Modelagem molecular; Inibidores; Câncer

The hexosamine biosynthetic pathway (HBP) is a branche of glucose metabolism that provides the activated monosaccharide uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc), an intracellular metabolic sensor used for glycosylation. The first stage of HBP is performed by the enzyme glutamine:fructose-6-phosphate-amidotransferase (GFAT). This enzyme has two domains, glutaminase and isomerase, which catalyze the formation of glucosamine-6-phosphate (GlcN-6P) from fructose-6-phosphate (Fru-6P) and glutamine (Gln). GFAT is conserved in all organisms studied so far, including bacteria, fungi and mammals. Humans have three different GFAT isoforms, termed GFAT1, GFAT1Alt and GFAT2, with GFAT1 having ubiquitous expression in tissues. GFAT2, in turn, shares 75% identity with GFAT1 and is expressed primarily in central nervous system. Interest in GFAT has increased in recent years, as this protein has been implicated in important human metabolic disorders. In cancer, it has been reported increased GFAT1 expression is in breast and prostate cancer, and upregulated GFAT2 expression is in pancreatic adenocarcinoma and colon cancer. Therefore, GFAT has been identified as a potential chemotherapeutic target for cancer. The commercial GFAT inhibitor is DON (6-diazo-5-oxo-L-norleucine), a Gln analog that irreversibly binds to the glutaminase site of the enzyme. In it is not used in the clinic because of its non-selectivity and cytotoxicity, being restricted to the use in research. Therefore, it is necessary to look for new potential GFAT inhibitors. In this work we studied strategies of human GFAT2 (GFAT2h) inhibition through the selection of potential selective inhibitors. In order to perform an extensive screening for potential GFAT inhibitors, we will use molecular modeling techniques, such as docking and virtual screening, to refine the selection of inhibitory prototypes and gain insights for future refinement of the structure. The main compounds resulting from the initial screening were tested and evaluated in vitro for their inhibitory activity. After successfully expressing and purifying human recombinant GFAT2 from Escherichia coli, the inhibitory activity of a series of compounds (LASSBio 1799, 1801, 1802, 1805, 1808, 1809, 1821 and 294) selected in silico, against the recombinant enzyme was evaluated by the Elson-Morgan assay, which detects the total amount of GlcN-6P formed. From the LASSBio series tested, only LASSBio 1799 and 1801 showed a slight inhibitory activity.

Keywords: GFAT; Hexosamine biosynthetic pathway; Molecular modeling; Inhibitors; Cancer.

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Estudo dos efeitos da sinalização MyD88-dependente intrínseca ao linfócito B sobre a diferenciação in vitro e homeostase periférica de células T reguladoras CD4+Foxp3+

Título: Estudo dos efeitos da sinalização MyD88-dependente intrínseca ao linfócito B sobre a diferenciação in vitro e homeostase periférica de células T reguladoras CD4+Foxp3+
Aluno: Carolina Paulino Pacini
Orientador(es): Prof. Fabio Barrozo Canto

As células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) são imprescindíveis para o estabelecimento da tolerância periférica. Essa população pode ser originada tanto no timo quanto no ambiente pós-tímico, e estudos recentes revelaram a importância das células Treg periféricas no controle da homeostase intestinal e da auto-tolerância. No compartimento periférico, linfócitos T convencionais CD4+CD25-Foxp3-(Tconv) podem ser induzidos a expressar o fator de transcrição chave do fenótipo supressor, Foxp3, após reconhecimento antigênico específico em presença de IL-2 e TGF-β. A indução pós-tímica de células Treg ocorre preferencialmente no nicho da mucosa intestinal e é significativamente modulada pela microbiota comensal. Apesar da célula dendrítica ser considerada o principal tipo celular envolvido na modulação da homeostase periférica de células Treg, nosso grupo e outros já demonstraram a importância de linfócitos B para geração de Treg no ambiente pós-tímico. No entanto, o papel da estimulação de linfócitos B por componentes microbianos sobre a modulação do compartimento de células Treg permanece obscuro. O objetivo deste trabalho, portanto, foi determinar a influência da sinalização MyD88-dependente nos linfócitos B, em resposta a componentes microbianos conservados evolutivamente, tanto na diferenciação in vitro de células Treg (iTreg) quanto na dinâmica populacional in vivo do compartimento de Treg presente em órgãos linfoides periféricos associados ou não à mucosa intestinal. Para determinar o impacto da sinalização do linfócito B por agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs) sobre a geração de iTreg, células Tconv CD4+CD25-Foxp3-, purificadas de camundongos.C57BL/6 Foxp3gfp por cell sorting, foram co-cultivadas, sob condição polarizante para o fenótipo regulador, com linfócitos B esplênicos isolados de doadores WT, Tlr9-/-, Myd88-/-ou Il6-/-, na presença ou ausência de CpG ou LPS. Nossos resultados demonstraram que o potencial dos linfócitos B em induzir a diferenciação de células T reguladoras in vitro foi inibido pelo CpG e LPS de maneira dependente de MyD88. A produção da citocina IL-6 pelos linfócitos B em resposta ao CpG contribuiu significativamente para a inibição da diferenciação de iTreg. Curiosamente, esta inibição correlacionou-se com níveis reduzidos de expressão de MHC classe II e marcadores de ativação pelos linfócitos B, num processo também mediado pela IL-6. Apesar de seu contato mais frequente com componentes microbianos in vivo, células B provenientes dos linfonodos mesentéricos (BmLN) foram tão competentes em potencializar a geração de iTreg quanto as de origem esplênica. Todavia, as células BmLN privadas do contato com a microbiota in vivo, por meio do tratamento de animais WT com antibióticos, foram mais eficientes na promoção de Treg in vitro. Corroborando com esse dado, foi encontrado um maior número absoluto de células Treg CD4+Foxp3+, decorrente de proliferação aumentada, nos linfonodos mesentéricos do animal deficiente em MyD88 exclusivamente nos linfócitos B (CD19CreMyd88flox/flox). Em comparação com o controle WT, este animal também apresentou números mais baixos de Treg CD25+ no baço e menor proliferação das células Foxp3+ totais nas placas de Peyer. Portanto, demonstramos que (i) a estimulação direta do linfócito B pelos ligantes de TLR CpG e LPS inibe seu potencial pró-Treg in vitro e (ii) a sinalização MyD88 dependente intrínseca ao linfócito B participa na modulação homeostática do compartimento periférico de células Treg. Esses dados contribuem para elucidação do eixo imunorregulatório entre linfócitos B, células T reguladoras e microbiota na fisiologia imunitária.

Palavras-chave: Células T reguladoras; linfócitos B; microbiota; receptores do tipo Toll; imunorregulação; Foxp3; MyD88

CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Treg) are essential for the establishment of peripheral tolerance. Treg cells can originate both within the thymus and in the post-thymic compartment, and recent studies have shown the role of peripherally-induced Treg cells (pTreg) on the control of gut homeostasis and self-tolerance. In the peripheral, compartment, conventional CD4+CD25-Foxp3- T lymphocytes (Tconv) can be induced to express the key suppressive transcription factor Foxp3 upon antigen-specific recognition in the presence of IL-2 and TGF-β. The post-thymic Treg cell differentiation occurs mainly in the intestinal mucosa, where it is significantly modulated by commensal microbiota. Although dendritic cells are considered the main cell type involved in the peripheral modulation of Treg cell homeostasis, we and others have already shown the relevance of B lymphocytes to Treg induction in the post-thymic environment. However, the role of B cell-stimulation by microbial components in modulating Treg cell compartment remains unexplored. The aim of the current study, therefore, was to investigate the influence of MyD88-dependent signaling on B lymphocytes, in response to conserved microbial components, on both in vitro-induced Treg (iTreg) cell differentiation and the Treg cell dynamics in vivo in secondary lymphoid organs related or not to the intestinal mucosa. To address the effect of B cell stimulation by Toll-like receptor (TLR) agonists upon iTreg generation, FACS-purified CD4+CD25-Foxp3- Tconv cells, isolated from C57BL/6.Foxp3gfp mice, were co-cultured under iTreg-polarizing conditions with splenic B lymphocytes isolated from either WT, Tlr9-/- , Myd88-/- or Il6-/- donors, in the presence or absence of CpG or LPS. Our results demonstrated that the ability of B cells to promote iTreg was inhibited by CpG and LPS in a MyD88-dependent manner. B cell-derived IL-6 produced in response to CpG contributed significantly for the inhibition of iTreg differentiation. Surprisingly, such inhibitory effect correlated with lower expression of MHC class II and activation markers by B lymphocytes in a process mediated by IL-6. Despite its persistent interaction with microbial components in vivo, B lymphocytes derived from mesenteric lymph nodes (BmLN) were as competent as splenic B cells in driving iTreg generation. Conversely, BmLN lymphocytes became more supportive of iTreg formation when their prior contact with microbiota in vivo was inhibited by antibiotic treatment of WT mice. In accordance with these data, we found higher numbers of CD4+Foxp3+ Treg cells, associated with increased proliferation, within the mesenteric lymph nodes of mice congenitally deficient forMyD88 expression exclusively on B lymphocytes (CD19CreMyd88flox/flox). In comparison to CD19WTMyd88flox/flox control littermates, the CD19CreMyd88flox/flox mice displayed lower levels of CD25+Foxp3+ Treg cells in the spleen and reduced Foxp3+ Treg cell proliferation in the Peyer’s patches. Therefore, we demonstrated here that (i) direct TLR-dependent sensing of CpG and LPS by B cells inhibits their pro-iTreg potential and (ii) the intrinsic B lymphocyte MyD88-signaling plays a role in the modulation of Treg compartment in vivo. Our findings provide new insights to the B lymphocyte-Treg cell-microbiota immunoregulatory axis.

Keywords: regulatory T cells; B lymphocytes; microbiota; Toll-like receptors; immune regulation; Foxp3; MyD88

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Dois lados de uma mesma moeda: Papel da fibra da dieta no desenvolvimento da peritonite e da sepse

Título: Dois lados de uma mesma moeda: Papel da fibra da dieta no desenvolvimento da peritonite e da sepse
Aluno: Bruno Jennings de Almeida
Orientador(es): Profa. Ana Carolina de Siqueira Couto De Oliveira

Peritonite é uma inflamação da cavidade peritoneal decorrente da invasão deste sítio por microrganismos do trato gastrointestinal, sendo caracterizada por uma resposta inflamatória intensa como um mecanismo de defesa do hospedeiro. Essa infecção pode desencadear diversas complicações, como o surgimento de abscessos intra-abdominais ou, quando não contida, evoluir para a sepse. A sepse é uma doença inflamatória sistêmica frequentemente desencadeada pela presença de bactérias na circulação sanguínea. Ela se apresenta em duas fases: uma fase aguda, em que há uma resposta inflamatória exacerbada com liberação de diversos mediadores que estão diretamente relacionados com a falência de órgãos; e uma fase tardia, caracterizada por um quadro de imunossupressão, que contribui para os comprometimentos tardios como infecções secundárias e tumores. Utilizando um modelo de peritonite induzida pela bactéria comensal Bacteroides fragilis e conteúdo cecal estéril (CCE), nosso grupo mostrou que a fibra proveniente da dieta é capaz de induzir resposta inflamatória através da ativação do inflamassomo NLRP3 e indução de IL-1, atuando como um sinal de perigo fora do intestino. No entanto, seu papel como prebiótico e fonte de metabólitos imunomoduladores, já descrito em outros cenários, não foi explorado neste modelo. Dentre os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) gerados a partir da fermentação da fibra pela microbiota intestinal, o acetato se destaca por sua importante função imunomoduladora através do receptor GPR43 em diversas doenças inflamatórias. Por isso, nesse projeto, pretendemos avaliar dois aspectos relacionados à ingestão da fibra proveniente da dieta: I) o que ela pode representar fora do intestino em um cenário de extravasamento do conteúdo colônico, confirmando os dados prévios do grupo e II) como ela pode influenciar, através da geração de AGCC, nas respostas inflamatórias que caracterizam a peritonite e a sepse. Inicialmente nós confirmamos que a fibra da dieta é, de fato, capaz de ativar caspase-1 e levar a produção de IL-1β em macrófagos, bem como levar ao desenvolvimento de peritonite de uma maneira dependente de IL-1. No que tange à função imunomoduladora de AGCC via GPR43, observamos que animais deficientes neste receptor são mais susceptíveis à peritonite induzida por B. fragilis e à sepse experimental induzida por cecal ligation and puncture (CLP), provavelmente por modular negativamente a resposta inflamatória, incluindo o recrutamento de neutrófilos. No que diz respeito à imunossupressão tardia pós sepse, observamos que há uma menor frequência de células Tregs e células dendríticas tolerogênicas em animais GPR43-/- sobreviventes à sepse. Nossos resultados mostram que a fibra fora do intestino pode representar um sinal de quebra da homeostase e levar a produção de IL-1β. Porém, quando no lúmen intestinal, a fibra gera metabólitos imunomoduladores que parecem ser importantes para atenuar o desenvolvimento de peritonite e sepse. Palavras-chave: peritonite; sepse; fibra; acetato; GPR43; imunomodulação.

Palavras-chave: Peritonite; Sepse; Fibra; Acetato; GPR43; Imunomodulação

Peritonitis is an inflammation of the peritoneal cavity resulting from the invasion of this site by microorganisms of the gastrointestinal tract, characterized by an intense inflammatory response as a defense mechanism of the host. This infection can trigger several complications, such as the appearance of intra-abdominal abscesses or, when not contained, progress to sepsis. Sepsis is a systemic inflammatory disease often triggered by the presence of bacteria in the bloodstream. It presents in two phases: an acute phase, in which there is an exacerbated inflammatory response with release of several mediators that are directly related to organ failure; and a late phase characterized by immunosuppression, which contributes to late complications such as secondary infections and tumors. Using a peritonitis model induced by the commensal bacteria Bacteroides fragilis and sterile cecal content (SCC), our group showed that dietary fiber is able to induce an inflammatory response through the activation of NLRP3 inflammasome and induction of IL-1β, acting as a sign of danger out of the gut. However, its role as a prebiotic and source of immunomodulatory metabolites, already described in other scenarios, was not explored in this model. Among the short chain fatty acids (SCFA) generated by fermentation of fiber by intestinal microbiota, acetate is notable for its important immunomodulatory function through the GPR43 receptor in several inflammatory diseases. Therefore, in this project, we intend to evaluate two aspects related to the dietary intake of fiber: I) what it can represent outside the gut in a scenario of extravasation of the colonic content, confirming the previous data of the group and II) how it can influence, through the generation of SCFA, on the inflammatory responses that characterize peritonitis and sepsis. Initially we confirmed that dietary fiber is, in fact, capable of activating caspase-1 and leading to IL-1β secretion in macrophages, as well as leading to the development of peritonitis in an IL-1 dependent manner. Regarding the immunomodulatory function of SCFA through GPR43, we observed that animals deficient in this receptor are more susceptible to B. fragilis-induced peritonitis and to experimental sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP), probably by negatively modulating the inflammatory response, including recruitment of neutrophils. Regarding late post - sepsal immunosuppression, we observed that there is a lower frequency of Treg cells and tolerogenic dendritic cells in GPR43-/- surviving sepsis animals. Our results show that the fiber outside the gut can represent a sign of homeostasis breaking and lead to IL-1β production. However, when in the intestinal lumen, fiber generates immunomodulatory metabolites that appear to be important in attenuating the development of peritonitis and sepsis.

Keywords: Peritonitis; sepsis; fiber; acetate; GPR43; immunomodulation.

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2018

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Papel imunomodulador dos linfócitos b na infecção experimental por leishmania amazonensis.

Título: Papel imunomodulador dos linfócitos b na infecção experimental por leishmania amazonensis.
Aluno(a): Luan Firmino Cruz
Orientador(es): Prof(a). Herbert Leonel de Matos Guedes

As Leishmanioses são um complexo de doenças negligenciadas e Leishmania amazonensis é o agente etiológico da leishmaniose cutânea difusa no Brasil. Os linfócitos B, ao contrário dos linfócitos T, ainda não têm papel bem definido nos modelos de infecção por parasitos do gênero Leishmania. Enquanto alguns trabalhos indicam um papel patogênico para esta população, outros indicam papel protetor e, por esse motivo, mais estudos a respeito destas células no contexto de infecção por parasítos do gênero Leishmania são necessários. Este trabalho tem como objetivo estudar a imunomodulação de linfócitos B durante o curso da infecção por L. amazonensis. Primeiramente, nós infectamos animais selvagens BALB/c (WT) e identificamos uma mudança no perfil do linfócito B1 peritoneal, com um aumento da população de linfócito B1b acompanhado de redução da população de linfócito B1a comparados às mesmas populações em animais não-infectados. Além disso, foi identificada também uma produção aumentada de IL-10 majoritariamente feita por linfócitos B2, quando comparados com linfócitos B2 derivados de animais nãoinfectados e com linfócitos T. Baseado nestes achados, avaliamos a infecção por L. amazonensis usando o modelo animal BALB/Xid, que apresenta baixo número de linfócitos B1 e redução na capacidade de ativação de linfócitos B2. Os camundongos foram infectados no coxim plantar e eutanasiados após 60 dias de infecção. Nossos resultados demonstraram que animais BALB/Xid desenvolveram menores lesões em VIII comparação com animais controle. Entretanto, não houve diferença nas cargas parasitárias obtidas no sítio da lesão, linfonodo drenante e baço de animais de ambos os grupos. Nós avaliamos a população de linfócitos B1 peritoneais em animais BALB/Xid, que é muito reduzida em relação aos WT; diferentemente do que foi encontrado nos animais WT, nós não observamos nenhuma diferença nas subpopulações B1a e B1b nos animais BALB/Xid infectados em comparação com o grupo não infectado. Nós observamos uma redução no número de linfócitos B2 de animais BALB/Xid em relação aos camundongos WT nos linfonodos drenantes de lesão. Camundongos BALB/Xid apresentaram menores níveis de IgM, IgG e IgG1 no soro quando comparados com animais WT, provavelmente por causa do baixo número de linfócitos B2. Não houve diferenças nos números de células CD8+ , CD4+ , CD4+ IFNg+ e T reguladoras (ou TReg, CD3+CD4+CD25+ FoxP3+ ) entre animais BALB/Xid e animais WT no linfonodo drenante da lesão. Animais BALB/Xid apresentaram níveis mais baixos de IL-10 no sítio da lesão, linfonodo drenante e no baço quando comparados com os mesmos tecidos de animais WT. Não detectamos diferenças no número de linfócitos T CD4+ e T CD8+ produtores de IL-10 entre camundongos WT e BALB/Xid; entretanto, animais BALB/Xid apresentaram números inferiores de linfócitos B2 produtores de IL-10 em comparação com animais WT. Para investigar a participação dos linfócitos B1 na produção de IL-10, nós cultivamos linfócitos B1 peritoneais estimulados ou não com LPS na presença ou ausência de L. amazonensis na forma promastigota. Linfócitos B1 foram capazes de produzir maiores quantidades de IL-10 quando estimulados com L. amazonensis e LPS em comparação com os controles. Nós isolamos cultivamos linfócitos B1 peritoneais de animais WT infectados e não infectados e os estimulamos com L. amazonensis nas formas promastigota e amastigota. Nós observamos que linfócitos B1 derivados de animais infectados, produziram mais IL-10 quando estimulados por amastigotas. Nós demonstramos que linfócitos B2 e B1 de animais infectados produzem IL-10 em experimentos ex vivo. Juntos, nossos dados indicam que linfócitos B estão associados com a patogênese relacionada à lesão, mas não à carga parasitária, na leishmaniose cutânea murina causada por Leishmania amazonensis através da produção de IgM, IgG e IL-10.

Palavras-chave: Leishmania amazonensis; Leishmaniose cutânea; IgM; IgG; IgG1; IL-10; linfócito B;

Leishmaniasis is a complex of neglected diseases and Leishmania amazonensis is the etiological agent of diffuse cutaneous leishmaniasis in Brazil. This work aims to study the immunomodulation of B lymphocytes during the course of L. amazonensis infection. Firstly, we infected BALB/c (WT) mice and identified a change in peritoneal B1 profile marked by an increase of B1b population and a decrease of B1a on infected WT mice in relation to naïve WT mice, besides that, the major source of IL10 was from B2 cell in comparison with T cells. Based on this finding, Leishmania amazonensis infection was evaluated using BALB/Xid mice as model that present lower number of B1 and reduction on activation capacity of B2 cells. Mice were infected on the footpad and euthanized at 60th day post infection. Our results demonstrated that BALB/Xid mice developed smaller lesions in comparison to WT control. However, the parasite load obtained from the infected footpad, spleen and lymph nodes were similar in both groups. We evaluated the peritoneal B1 population on BALB/Xid mice that is reduced in relation to WT mice; differently from what has been found in WT mice, we did not observe any difference in B1a and B1b in infected mice in comparison with naïve BALB/Xid mice. We observed a reduction in the number of B2 cells from BALB/Xid mice in relation to WT mice in the lymph nodes. BALB/Xid mice presented lower levels of IgM, IgG and IgG1 in the serum when compared with WT mice, probably due to the lower number of B2 cells. There was no difference in the number of CD8+ , CD4+ , CD4+ IFNg+ and regulatory T (TReg) cells (CD3+CD4+CD25+ FoxP3+) between BALB/Xid and WT mice in the draining lymph node. BALB/Xid mice presented lower levels of IL-10 in the infected footpad, draining lymph nodes and in the spleen when compared with WT infected tissues. We could not detect differences between the number of IL-10 producing T CD4+ cells and T CD8+ cells in WT and BALB/Xid mice; however, a strong reduction of IL-10 producing B2 cells was noted in BALB/Xid mice. To investigate the participation of B1 in IL-10 production, we performed in vitro interaction using peritoneal B1 lymphocytes stimulated by LPS in the presence or absence of L. amazonensis. B1 lymphocytes were able to produce higher levels of IL-10 when exposed to L. amazonensis plus LPS in comparison with the controls. We isolated and cultured B1 cells from naïve and infected mice and we stimulated with promastigotes and mastigotes, we observed that B1 cells from infected mice produced IL-10 stimulated by amastigotes. We demonstrated that B2 and B1 cells from infected mice produce IL-10 in ex vivo experiments. Together, our data indicate that B cells are associated with lesion pathogenesis in murine cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis through the production of IgM, IgG1 and IL-10, but not with the parasite load.

Keywords: Leishmania amazonensis; Cutaneous leishmaniasis ;IgM; IgG; IgG1; IL10; B lymphocyte

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O papel do Inflamossomo na Imunopatogênese da asma experimental causada pela exposição crônica ao aspergillus fumigatus.

Título: O papel do Inflamossomo na Imunopatogênese da asma experimental causada pela exposição crônica ao aspergillus fumigatus.
Aluno(a): Marcella Almeida Azevedo Detoni
Orientador(es): Prof(a). Rodrigo Tinoco Figueiredo

A asma é uma doença caracterizada pela inflamação crônica das vias aéreas, existindo duas características marcantes, a inflamação crônica e o remodelamento, resultando na principal manifestação fisiopatológica, que é a hiper-reatividade das vias aéreas. A resposta brônquica exagerada pode ser induzida por fatores ambientais como alérgenos, entre eles os fungos. Em humanos, uma associação entre a exposição aos fungos, em particular ao Aspergillus fumigatus, e a asma é reconhecida clinicamente e epidemiologicamente. Corroborando os estudos epidemiológicos, modelos experimentais de indução de inflamação alérgica pulmonar em camundongos podem ser mimetizados pela imunização e/ ou desafio com antígenos ou conídios do A. fumigatus. Componentes da parede celular do A. fumigatus servem como ligantes para receptores de reconhecimento de padrão (PRRs). Entre os PRRs, as células hospedeiras podem ser equipadas com receptores de reconhecimento de padrão citoplasmáticos capazes de desencadear a montagem do inflamossomo. Os inflamossomos são plataformas de sinalização molecular que controlam a ativação da caspase-1. O inflamossomo NLRP3 têm sido implicado no desenvolvimento de asma, no entanto, o papel do inflamassomo na inflamação alérgica pulmonar é controverso. Logo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do inflamossomo na imunopatogênese da asma experimental causada por exposição crônica ao A.fumigatus. No modelo de exposição crônica ao A. fumigatus que desenvolvemos os camundongos Casp1-/-Casp11Sv129def que foram desafiados com A. fumigatus apresentaram maior hiper-reatividade das vias aéreas, inflamação pulmonar com eosinofilia e produção de muco quando comparados aos camundongos selvagens desafiados com o fungo. Estes resultados em conjunto mostram inflamação pulmonar e patologia aumentadas na ausência de caspase-1/11, sugerindo um papel modulador negativo da caspase1 e /ou caspase-11 na inflamação alérgica pulmonar no modelo de exposição crônica ao A. fumigatus.

Palavras-chave: asma; inflamossomo; Aspergillus fumigatus; fungo;caspase-1; conídios; crônica

Asthma is a disease characterized by chronic airway inflammation, with two marked features: chronic inflammation and remodeling, resulting in the main pathophysiological manifestation, which is airway hyperreactivity. Exaggerated bronchial response may be induced by environmental factors such as allergens, including fungi. In humans, an association between exposure to fungi, in particular Aspergillus fumigatus, and asthma is clinically and epidemiologically recognized. Corroborating epidemiological studies, experimental models of pulmonary allergic inflammation induction in mice can be mimicked by immunization and / or challenge with A. fumigatus antigens or conidia. A. fumigatus cell wall components serve as ligands for pattern recognition receptors (PRRs). Regarding PRRs, host cells may be equipped with cytoplasmic PRRs, which are capable of triggering inflammassome assembly. Inflamamosomes are molecular signaling platforms that control caspase-1 activation. NLRP3 inflamossome has been implicated in the development of asthma; however, its role in allergic lung inflammation is controversial. Thus, this project aim was to evaluate inflammassome role in experimental asthma immunopathogenesis caused by chronic exposure to A. fumigatus. In A. fumigatus chronic exposure model, Casp1 -/- Casp11Sv129def mice that were challenged with A. fumigatus showed greater airway hyperresponsiveness, pulmonary inflammation with eosinophilia and mucus production when compared to wild-type mice challenged with fungus. These results show increased pulmonary inflammation and pathology in the absence of caspase-1/11, suggesting a negative modulatory role of caspase-1 and / or caspase-11 in pulmonary allergic inflammation in A. fumigatus chronic exposure model.

Keywords: asthma; inflammassome; Aspergillus fumigatus; fungus;caspase-1; conidia; chronic

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Diversidade Funcional de Vesículas Extracelulares Fúngicas na Interação com Células Dendríticas e Influência na Patogênese.

Título: Diversidade Funcional de Vesículas Extracelulares Fúngicas na Interação com Células Dendríticas e Influência na Patogênese.
Aluno(a): Leandro Honorato de Amorim
Orientador(es): Prof(a). Leonardo Nimrichter

As espécies do gênero Candida são os principais causadores de infecções fúngicas, com destaque para Candida albicans (Ca) e Candida parapsilosis (Cp). Nos últimos anos tem se investigado o papel das vesículas extracelular (VEs) na interação com células hospedeiras, comunicação entre células e remodelamento da parede celular. Contudo, como as células do hospedeiro reconhecem e respondem a estas VEs, assim como as VEs influenciam na virulência do fungo carecem de mais estudos. Neste contexto, investigamos a resposta de células diferenciadas da medula com GMCSF de camundongos C57BL/6 Wild Type, TLR4 -/- , TLR2 -/-, CLEC7a -/- e MyD88 -/- após o estímulo com VEs de Ca e Cp mostrando uma redução acentuada na resposta de citocinas nas células deficientes de TLR4 -/- e MyD88 -/- . Enquanto os resultados de citometria de fluxo e western blot indicam que apesar da participação de TLR4 na produção de citocina, este receptor parece não ser o único responsável pela expressão de moléculas co-estimulatórias e da ativação do Fator Nuclear Kappa B (NFkB), sugerindo a ação de outro(s) receptor(es) no reconhecimento. Com o uso de cepas de Ca mutantes em N- manana e N- e O- manana observou-se que a secreção da interleucina 6 foi reduzida e aumentada, respectivamente, indicando que alterações no padrão de manosilação influenciam na resposta do hospedeiro. O padrão de manosilação também parece influenciar o tamanho e a bigênese das VES. Por outro lado, os dados de interação das VEs de Ca com a própria Candida mostram que o seu pré-tratamento com as VEs durante 24 horas reduziram sua virulência, enquanto a administração simultânea de VEs de Ca e o fungo aumentam a virulência em um modelo de Galleria mellonella. Esses dados sugerem que as VEs têm um papel importante tanto no hospedeiro quanto no próprio fungo de maneira distinta.

Palavras-chave: Candida parapsilosis; vesículas extracelular

Candida species are the main cause of fungal infections, especially Candida albicans (Ca) and Candida parapsilosis (Cp). In recent years the role of extracellular vesicles (EVs) in the interaction with host cells, cell communication and cell wall remodeling has been investigated. However, the mechanism by which host cells recognize and respond to these EVs, as well as EVs influence the virulence requires further studies. In this context, we investigated the response of GM-CSF bone marrow derived cells from C57BL/ 6 wild-type mice, TLR4 - / - , TLR2 - / - , CLEC7a - / - and MyD88 - / - mice after stimulation with EVs from Ca and Cp. A marked reduction in the cytokine response in TLR4 - / - and MyD88 - / - deficient cells was observed. While the results of flow cytometry and western blot indicated that despite the influence of TLR4 on cytokine production, TLR4 seems not to be the only responsible for the expression of costimulatory molecules and the activation of the Nuclear Kappa B Factor (NFkB), suggesting the action of other receptors during EVs recognition. With the use of Ca mutants in Nmannan and N-and O-mannan it was observed that the secretion of interleukin 6 was reduced and increased, respectively, indicating that changes in the mannosylation pattern influence on the host response. In addition, the glycan chain of mannoproteins also seems to modify the size and biogenesis of EVS. On the other hand, the interaction data of Ca VEs with Candida itself showed that their pre-treatment with EVs for 24 hours reduced significative their virulence, while the simultaneous administration of Ca EVs and fungus increased virulence in a model of Galleria mellonella. Together, these data indicate that EVs play an important role both in the host and in the fungus itself in a different way.

Keywords: Candida species; Candida parapsilosis; fungal infections

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O papel da il-18 na modulação da resposta de linfócitos t γδ durante a infecção experimental por trypanosoma cruzi.

Título: O papel da il-18 na modulação da resposta de linfócitos t γδ durante a infecção experimental por trypanosoma cruzi.
Aluno(a): Julia Barbalho da Mota
Orientador(es): Prof(a). Ana Carolina de Siqueira Couto de Oliveira

Os linfócitos T γδ apresentam características inatas e adquiridas, desempenhando papéis importantes na modulação de respostas imunes e respondendo a patógenos. Recentemente, estudos tem demonstrado que a citocina IL-18 (i) aumenta a expansão e ativação de linfócitos T γδ, os quais produzem altos níveis de citocinas pró-inflamatórias como IFNγ/TNFα, (ii) induz a polarização para um fenótipo de citotoxicidade contra células tumorais e (iii) sinaliza intrinsicamente em células T αβ, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta Th1 protetora durante a infecção por Trypanosoma cruzi. Diferentes subtipos de células T participam da resistência à infecção por este parasita, no entanto, pouco se sabe sobre o papel dos linfócitos T γδ neste contexto. Os objetivos principais do nosso trabalho foram (i) avaliar o fenótipo das células T γδ durante a infecção aguda por T.cruzi e (ii) estudar a importância da sinalização por IL-18 nestas células no contexto da infecção. Na primeira parte do nosso trabalho, utilizamos camundongos C57BL/6 infectados intraperitonealmente (i.p.) com 2 x 10³ tripomastigotas sanguíneos da cepa Y de T. cruzi para avaliar o perfil das células T γδ ao longo da infecção. Observamos que as células T γδ esplênicas expandem principalmente entre 14 e 21 dias pós-infecção (dpi). De forma semelhante ao encontrado no baço, a cinética do infiltrado intracardíaco de células T γδ durante a infecção por T. cruzi revelou que o pico ocorre por volta de 14 dpi e gradualmente reduz até 21 dpi. A curva de parasitismo intracardíaco, medida por PCR quantitativo, seguiu a cinética do infiltrado de células T γδ, indicando um possível papel dessas células no controle da infecção por T. cruzi. A fim de avaliar o papel de vias de sinalização dependentes da molécula adaptadora MyD88 na expansão de células T γδ, nós infectamos animais MyD88-/- (infecção i.p. com 2 x 10³ tripomastigostas sanguíneos da cepa Y) e avaliamos comparativamente à animais C57BL/6 (selvagens) os percentuais de linfócitos T γδ no baço e no coração com 14dpi. Nós observamos que as células T γδ foram significativamente reduzidas nos animais nocautes quando comparados aos animais selvagens, tanto no baço quanto no coração. Em seguida, avaliamos especificamente a influência da sinalização por IL-18R, via dependente de MyD88, nas células T γδ durante a infecção por T. cruzi. Experimentos in vitro com células T γδ purificadas do baço de animais WT e IL-18R-/- infectados demonstraram que as células T γδ IL18R-/- expandem menos e são menos ativadas (CD27+, produtoras de IFN- γ ou GzB+, citotóxicas) do que células T γδ WT após estimulo em cultura. Esse fenótipo foi corroborado por experimentos in vivo, onde animais IL-18R-/- infectados (14 dpi) apresentaram frequências reduzidas de células T γδ no baço e no coração. Além disso, as células T γδ citotóxicas GranzimaB+ e efetoras IFNγ+ também foram reduzidas no baço de camundongos IL-18R-/- em relação aos WT. Em seguida, realizamos experimentos de citotoxicidade in vitro para avaliar comparativamente o potencial citotóxico de células T γδ WT e IL-18R-/- frente a macrófagos infectados por T. cruzi. Observamos que as células WT apresentam citotoxicidade aumentada em relação às células IL-18R-/-. Por fim, com o intuito de investigar o papel protetor de células T γδ, realizamos a transferência adotiva de células T γδ WT para animais IL-18R-/-, susceptíveis a infecção. Observamos que a transferência é capaz de reverter a mortalidade dos animais nocautes, além de reduzir a parasitemia em relação aos animais não transferidos. Dessa forma, nossos resultados demonstram que a sinalização por IL-18R/MyD88 contribui para a expansão e ativação de células T γδ durante a infecção aguda por T. cruzi, sendo essas células importantes para o controle do parasitismo e modulação da resposta imune via produção de IFN-γ, favorecendo, portanto, a resolução da infecção.

Palavras-chave: Trypanosoma cruzi; IL-18;linfócitos T γδ; citotoxicidade; IFN-γ; resposta imune Th1

Gamma-delta T cells present innate and acquired immunity properties and play important roles in modulating immune responses and responding to pathogens. Recently, studies have shown that the cytokine IL-18 (i) enhances γδ T cell expansion and activation, which produce high levels of proinflammatory cytokines such as IFNγ / TNFα, (ii) induces a cytotoxic phenotype of γδ T cells against tumor cells and (iii) contributes to the development of a protective Th1 response during Trypanosoma cruzi infection by intrinsic signaling in conventional T cells. Different subtypes of T cells participate in the resistance to Trypanosoma cruzi infection, however, the role of γδ T lymphocytes in this context remains unclear. The aim of our work was to evaluate the phenotype of γδ T cells in acute infection with T.cruzi and study the importance of IL-18 signaling on these cells within the context of this protozoan infection. In order to analyze the γδ T cell profile throughout the infection, C57Bl/6 mice were inoculated intraperitoneally (ip.) with 2 x 10³ blood trypomastigotes of the Y strain of T. cruzi. We observed that splenic γδ T cells expand mainly between 14 and 21 days post infection (dpi). Similarly to the spleen, the kinetics of γδ T cells infiltrate in the heart during T. cruzi infection revealed that the peak occurred around 14 dpi and gradually decreased at 21 dpi. The intracardiac parasitism curve, measured by qPCR, followed the kinetics of γδ T cells infiltrate, indicating a possible role of these cells in control of T. cruzi infection. To evaluate the role of MyD88-dependent signaling pathways in the expansion of γδ T cells, MyD88-/- and C57Bl/6 mice were inoculated intraperitoneally (ip.) with 2 x 10³ blood trypomastigotes of the Y strain of T. cruzi. At 14 dpi, we observed that γδ T cells were significantly reduced in MyD88-/- mice, as compared to WT mice, both in the spleen and in the heart, demonstrating that MyD88-dependent signaling pathways cooperate for the proliferation of this cell population. In order to evaluate the influence of IL-18R signaling pathway on γδ T cells during T. cruzi infection, in vitro experiments were performed with sorted γδ T cells from infected mice. We observed that IL18R-/- γδ T cells expand less and are less activated (CD27 +/GzB+) than WT γδ T cells in culture after stimulation. This phenotype was corroborated by in vivo experiments. At 14 dpi, IL18R-/- mice displayed reduced frequencies of γδ T cells in the spleen and in the heart. In addition, GzB+ and IFN-γ+ γδ T cells were also reduced in the spleen of IL-18R-/- mice as compared to WT. Next, we performed in vitro cytotoxicity experiments with co-cultivated WT or IL-18R-/- γδ T cells and T. cruzi-infected macrophages. We observed that WT cells displayed increased cytotoxicity as compared to IL-18R-/- cells, demonstrating that IL-18R / MyD88 signaling induces a cytotoxic phenotype in γδ T cells during T. cruzi infection. Finally, in order to investigate the protective role of γδ T cells, we performed adoptive transfer of WT γδ T cells to IL-18R-/- susceptible mice. We observed that the transference reverted the mortality and reduced the parasitemia of knockout mice as compared to the nontransferred animals. Our results demonstrate that IL-18R / MyD88 signaling contributes to the expansion and activation of γδ T cells during acute T. cruzi infection. Moreover, these cells seem important to the control of parasitism and modulation of the immune response through IFN-γ production.

Keywords: Trypanosoma cruzi; IL-18; γδ T cells; cytotoxicity; IFN-γ; Th1 immune response

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Mecanismos moleculares envolvidos na liberação de redes extracelulares de dna por eosinófilos humanos em resposta ao fungo aspergillus fumigatus.

Título: Mecanismos moleculares envolvidos na liberação de redes extracelulares de dna por eosinófilos humanos em resposta ao fungo aspergillus fumigatus.
Aluno(a): Isabella Gropillo de Carvalho Gomes
Orientador(es): Prof(a). Josiane Sabbadini Neves

Eosinófilos são granulócitos classicamente relacionados a doenças alérgicas e a respostas imunes do hospedeiro a helmintos, bactérias e também fungos. A liberação de redes extracelulares de DNA por leucócitos é um mecanismo importante da resposta imune inata a patógenos em diferentes condições infecciosas, incluindo infecções fúngicas. Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) é um fungo oportunista responsável pela aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA), uma doença pulmonar marcada por uma inflamação eosinofílica proeminente. Estudos anteriores de nosso grupo demonstraram que eosinófilos humanos isolados liberam redes extracelulares de DNA (EETs) quando estimulados por A. fumigatus in vitro em um mecanismo dependente de CD11b e Syk tirosina quinase e que envolve a morte da célula, mas independe de espécies reativas de oxigênio. Dentro deste contexto, neste trabalho o objetivo foi dar continuidade aos estudos anteriores e contribuir com a elucidação de outros mecanismos importantes que estariam orquestrando a liberação de EETs em resposta ao A. fumigatus com foco na investigação do papel de diferentes proteínas quinases e da necessidade da viabilidade do fungo para a indução das EETs. Para isso, eosinófilos do sangue de doadores saudáveis foram isolados por seleção imunomagnética negativa e pré-tratados durante 30 minutos com inibidores farmacológicos de diferentes quinases, incluindo PP2 (inibidor da família Src; 10 μM), wortmanin (pan-inibidor de PI3K; 0,1 μM), AS605240 (inibidor de IP3K de classe I; 1 μM), IC-87114 (inibidor de IP3Kδ; 1 μM), SB202190 (inibidor de p38 MAPK; 10 μM) e inibidor de AKT VII (2,6 μM) e depois estimulados com A. fumigatus numa proporção célula:fungo 1:10 por 6h. Observamos que os tratamentos com PP2 ou wortmanin aboliram completamente a liberação de EETs induzida por A. fumigatus. Para confirmar a participação de PI3K de classe I e PI3Kδ neste processo, utilizamos os compostos AS605240 e IC-87114 respectivamente. Tanto o tratamento com o composto AS605240 quanto o IC-87114 sugerem um efeito inibitório, entretanto ainda com ausência de significância estatística. Os resultados também sugerem que p38 MAPK e AKT estão envolvidas na liberação de EET induzida por A. fumigatus, entretanto ainda sem a certeza da significância estatística. De acordo com os experimentos realizados até o momento, nenhum tipo de toxicidade foi verificada para os inibidores utilizados tanto em relação aos eosinófilos, como em relação ao fungo. Os resultados também indicam que a liberação de EETs independe da viabilidade do A. fumigatus. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a liberação de EET induzida por A. fumigatus depende da sinalização da família Src quinase, PI3K e, possivelmente, p38 MAPK e AKT. O mecanismo de liberação de EETs frente ao A. fumigatus parece ser independe da viabilidade do A. fumigatus e provavelmente envolve o reconhecimento de moléculas da parede celular do fungo, e não moléculas secretadas por ele.
Palavras Chave: Eosinófilos; A. fumigatus; redes extracelulares de DNA; aspergilose bronco pulmonar alérgica

Eosinophils are granulocytes classically involved in allergic diseases and in the host immune responses to helminths, fungi, bacteria and also virus. The release of extracellular DNA traps by leukocytes is an important mechanism of the innate immune response to pathogens in different infectious conditions, including fungal infections. Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is an opportunistic fungus responsible for the allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA), a pulmonary disease marked by a prominent eosinophilic inflammation. Previously, we demonstrated that isolated human eosinophils release DNA extracellular traps (EETs) when stimulated by A. fumigatus in vitro in a mechanism that involves CD11b and Syk tyrosine kinase, and which involves the death of the cell, but not reactive oxygen species. In this work, our aim was to continue the previous studies and contribute to the elucidation of other mechanisms that orchestrate the release of EETs in response to A. fumigatus with focus on the role of different protein kinases and the need for the fungus viability to induce EET release. To achieve this purpose, we isolated eosinophils from the blood of healthy donors by negative immunomagnetic selection, pretreated for 30 minutes with different pharmacological inhibitors to different kinases including PP2 (10 M; Src family inhibitor), wortmannin (0,1 M; IP3K pan-inhibitor), AS605240 (1 µM; class I IP3K inhibitor), IC-87114 (1 µM; IP3K δ inhibitor), SB202190 (10 M; p38 MAPK inhibitor) and AKT inhibitor VII (2,6 µM), and then stimulated with A. fumigatus in a cell:fungi ratio of 1:10 for 6h. We observed that the treatment with PP2 or wortmannin completely abrogated the A. fumigatus-induced EETs release. To confirm the participation of class I IP3K and IP3Kδ in this process, we used AS605240 and IC87114, respectively. Both treatments with AS605240 or IC-87114 suggest an inhibitory effect, although still lacking statistical significance. The results also suggest that p38 MAPK and AKT are involved in A. fumigatus-induced EETs release, however the statistical significance is not certain. According to the obtained results, no toxicity was observed for the inhibitors used, neither for eosinophils, nor for the fungus. The results also indicate that EETs release is not dependent on the viability of A. fumigatus. In conclusion, our results showed that A. fumigatusinduced EETs release is dependent on the Src family, IP3K signaling and, possibly, p38 MAPK and AKT. The mechanism of A.fumigatus-induced EETs release is not dependent of fungus viability and probably involves recognition of fungus cell wall molecules, but not fungussecreted molecules.
Keywords: Eosinophils; A. fumigatus; extracellular DNA traps; allergic broncho pulmonary aspergillosis

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2017

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O papel do receptor dectina-1 na imunidade inata ao fungo patogênico Pseudallescheria boydii.

Título: O papel do receptor dectina-1 na imunidade inata ao fungo patogênico Pseudallescheria boydii.
Aluno(a): Yasmim Aurora Vieira Braga
Orientador(es): Prof(a). Rodrigo Tinoco Figueiredo

As infecções fúngicas invasivas tem aumentado nas últimas décadas, representando uma importante causa de mortalidade e morbidade em indivíduos imunosuprimidos. Pseudallescheria boydii é um fungo oportunista causador de infecções invasivas em indivíduos imunocomprometidos, sendo, além disso, o principal agente causador de micetomas micóticos, condição que acomete indivíduos imunocompetentes. P. boydii é amplamente distribuído na natureza, encontrado principalmente como saprófita de águas de rios, solo, estrumes, lamas de esgoto e pântano. Sabe-se que receptores da imunidade inata desempenham um papel essencial no reconhecimento imune inato de fungos patogênicos. TLR2, TLR4 e Dectina-1 estão envolvidos na indução da produção de mediadores inflamatórios em resposta a fungos patogênicos. Além disso, o reconhecimento de fungos é capaz de ativar o inflamassomo, promovendo a produção de IL-1β e ativação de caspase-1 por um mecanismo mediado por NLRP3, ou ainda por mecanismos independentes de NLRP3 e dependentes da caspase-8, AIM2, ou ativação constitutiva da caspase-1. Contudo, o papel e a contribuição de diversos receptores da imunidade inata no reconhecimento e imunidade à infecção pelo P. boydii são largamente desconhecidos. Assim, investigamos o papel do receptor de β-glucanas, a Dectina-1, no reconhecimento imune inato de P. boydii. Nossos resultados demonstram que o reconhecimento de conídios de P. boydii por Dectina-1 e TLR4 promove a liberação de citocinas pró-inflamatórias e a fagocitose requer o reconhecimento mediado por Dectina-1 dos conídios de P. boydii por macrófagos. O processo de germinação de conídios começa em torno de 6h e 9h completando a morfogênese para diferenciação em hifas no tempo de 24h. P. boydii não é capaz de induzir a produção de ROS em macrófagos peritoneais murinos, o receptor Dectina-1 não foi necessário para a atividade fungicida/fungistática. Os conídios em repouso apresentaram baixa ligação a Dectina-1 Fc, sendo esta aumentada em 6h de germinação, atingindo um máximo de ligação em 9h. A liberação de IL-1β em resposta a P. boydii necessitou do reconhecimento mediado pela cooperação entre TLR4 e Dectina-1 e da ativação do inflamassomo dependente de NLRP3/caspase-1. Em um modelo experimental de infecção dérmica por inoculação de P. boydii, Dectina-1 é necessária para o controle da lesão durante a infecção. Nossos resultados demonstram que o receptor de β-glucanas, Dectina-1, desempenha um papel essencial no reconhecimento do fungo patogênico P. boydii. Deste modo, nossos resultados trazem uma contribuição importante para a compreensão das infecções causadas por esse fungo.

Palavras-chave: Pseudallescheria boydii; Reconhecimento imune inato;I nflamossomo;Dectina-1; TLR4

Invasive fungal infections have increased in the last decades, representing an important cause of mortality and morbidity in immunosuppressed individuals. Pseudallescheria boydii is an opportunistic fungus that causes invasive infections in immunocompromised individuals, being also the main causative agent of mycetomas mycosis, a condition that affects immunocompetent individuals. P. boydii is widely distributed in nature, mainly found as saprophyte of rivers, soil, manures, sewage sludge and marshes. It is known that innate immunity receptors play an essential role in the innate immune recognition of pathogenic fungi. TLR2, TLR4 and Dectin-1 are involved in the production of inflammatory mediators in response to pathogenic fungi. In addition, fungal recognition is capable of activating the inflammasome, promoting the production of IL-1β and activation of caspase-1 by an NLRP3-mediated mechanism, or by NLRP3 independent mechanisms involving caspase-8 activation, AIM2 or constitutive activation of caspase-1. However the role and contribution of various receptors of innate immunity in the recognition and immunity to P. boydii infection are largely unknown. Thus, we investigated the role of the β-glucan receptor, Dectin-1, in the innate immune recognition of P. boydii. Our results demonstrate that the recognition of P. boydii conidia by Dectin-1 and TLR4 promotes the release of proinflammatory cytokines and phagocytosis of P. boydii conidida by macrophages requires Dectin-1-mediated recognition. The conidial germination begins around 6h and 9h, completing morphogenesis for differentiation in hyphae at 24h. P. boydii is not able to induce ROS production in murine peritoneal macrophages, and Dectin-1 receptor was not required for fungicide/fungistatic activity. At rest, conidia had a low binding to Dectin-1 Fc and Dectin-1 Fc binding was increased after 6h germination reaching a maximum binding in 9h. Release of IL-1β in response to P. boydii required recognition mediated by the co-operation between TLR4 and Dectin-1 and NLRP3/caspase-1 activation . In an experimental model of skin infection by inoculation of P. boydii, Dectin-1 is required for the control of the lesion during infection. Our results demonstrate that the β-glucan Dectin-1 receptor plays an essential role in the recognition of the pathogenic fungus P. boydii. Thus, our results make an important contribution to understanding the infections caused by P. boydii.

Keyword: Pseudallescheria boydii; immune recognition; Inflamosmome; Dectin-1; TLR4

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Perfil de linfócitos T tecido-específico na homeostasia e durante a resposta imunológica em modelo experimental (murino) de câncer de mama metastático.

Título: Perfil de linfócitos T tecido-específico na homeostasia e durante a resposta imunológica em modelo experimental (murino) de câncer de mama metastático.
Aluno(a): Marina Vieira Agostinho Pereira
Orientador(es): Prof(a). Adriana Cesar Bonomo

No cenário de constante busca ao entendimento dos mecanismos de desenvolvimento e estabelecimento metastático o microambiente tumoral desempenha importante papel pró/anti colonização tumoral. Como integrante desse nicho tumoral temos as células do sistema imune. Quanto ao papel dos linfócitos T nesse contexto, nosso grupo mostrou, no modelo de tumor de mama 4T1, que a metástase óssea ocorre de forma dependente de linfócitos T CD4 RANKL+ que preparam o nicho ósseo para a chegada do tumor. Entretanto, dados da literatura sugerem que linfócitos T CD4 IL4+ em modelo de tumor de mama são essenciais para que a metástase pulmonar ocorra. Esses dados denotam a importância das células T para o estabelecimento da metástase, bem como despontam a especificidade tecidual das células T, que alteraram seu fenótipo de acordo com o nicho metastático. Contudo, os trabalhos citados utilizam modelos animais distintos. Logo, nos perguntamos como estaria o perfil dos linfócitos nos diferentes órgãos alvo da metástase em um mesmo sistema, considerando que cada tecido possui sua própria homeostasia e possíveis alterações no microambiente se tornam potenciais marcadores preditores de metástase auxiliando no diagnóstico precoce e em futura abordagem terapêutica. Através da citometria de fluxo observamos o percentual de células T CD4+ e T CD4- produtoras das citocinas TNFα, INFγ, IL13, RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF Análises por bioinformática dos dados mostram que os grupos controles apresentam diferentes perfis de citocinas em cada órgão tanto para células TCD4+ quanto TCD4-. O mesmo ocorre quando os animais inoculados com o tumor por 17 e 23 dias, quando há colonização metastática em todos os órgãos. No entanto, no dia 17 os perfis de linfócitos CD4+ ou CD4- em cada órgão é modificado. A análise estatística pontual de cada citocina pelos gráficos de barra mostra que durante a homeostasia TNFα é a citocina com produção predominante, tanto em células T CD4+ quanto em T CD4-, em todos os órgãos, exceto no fígado e tende a aumentar mesmo antes da colonização tumoral. Observamos que em todos os órgãos em D17 as citocinas RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF são alteradas aumentando o percentual de células produtoras com a progressão do tumor. Linfócitos T CD4+ aumentam a produção de RANKL no linfonodo, baço, fígado e medula. Enquanto GM-CSF aumenta no baço, fígado, pulmão e medula. O percentual de células TCD4+ produtoras de IL13 em D17 aumenta apenas no baço, pulmão e fígado, com destaque nas TCD4- no pulmão e no fígado. As células TCD4- também apresentaram maior variação das citocinas RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF, com destaque para aumento percentual de células produtoras dessas citocinas principalmente no baço e no fígado. Acreditamos que estes dados possam ser usados para prever metástases sítio específicas em seres humanos. Palavras-chave: câncer, metástase; linfócitos T; microambiente metastático

Palavras-chave: linfócitos T;microambiente metastático;câncer;metástase

In this scenario of constant search for understanding the mechanisms of tumor development and establishment, the tumor microenvironment plays an important role. As part of the tumor niche there are the cells of the immune system. Regarding the role of T lymphocytes in this context, our group showed, in the 4T1 breast tumor model, that bone metastasis isdepends on RANKL + CD4 T lymphocytes that prepare the bone pre-metastatic niche for tumor arrival. Literature data suggest that CD4 IL4 + T lymphocytes in a different model of breast tumor, are essential for pulmonary metastasis. These data denote the importance of T cells for the establishment of metastasis as well as the tissue specificity of T cells that have different phenotypes according to the metastatic niche. However, the cited works use different animal models. Therefore, we asked how the lymphocyte profile in the different target organs of the metastases in the same system would be, considering that each tissue has its own homeostasis and antigen not microenvironment become potential predictive markers of metastasis, adding in early diagnosis and in future therapy approaches. The percentage of the cytokines TNFα, INFγ, IL13, RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF produced by CD3 + CD4 + and CD3 + CD4- T cells was obtained by flow cytometry, Bioinformatic analyzes of the data show different cytokine profiles in each organ for both CD4 + and TCD4- cells. The same occurs when the data of the animals inoculated with the tumor by 17 and 23 days. The statistical analysis of each cytokine by bar graphs shows that in homeostasis, TNFα is the predominant, both in CD4 + T cells and in CD4 T, in all organs, except in the liver, and tends to increase during tumor colonization. We observed that all organs in D17 alter RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF production, increasing the percentage of producing cells with tumor progression, although still before metastatic colonization. Percentages of CD4 producing RANKL in the lymph node, spleen, liver and marrow increase, while GM-CSF increases in D17 in the spleen, liver, lung and marrow. Percentage of IL13-producing CD4+ cells in D17 increases in spleen, lung and liver. and TCD4- cells also increase the production of this cytokine. TCD4 - cells showed the greatest variation on the cytokines RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF, with highlight to the percentage increase of cytokine producing cells mainly in the spleen and liver. Key words: cancer; metastasis; T lymphocytes; metastatic microenvironment

Keyword: cancer;metastasis;T lymphocytes;metastatic microenvironment

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Indução da tolerância a transplante de pele com uso de LLactis como adjuvante tolerogênico.

Título: Indução da tolerância a transplante de pele com uso de LLactis como adjuvante tolerogênico.
Aluno(a): Luciano Sanuto Leite
Orientador(es): Prof(a). Adriana Cesar Bonomo

Os diferentes tipos de transplantes de órgãos sólidos e tecidos compartilham semelhante dificuldade, relacionadas as incompatibilidades do Complexo Histocompatibilidade Maior (MHC) e Antígenos de Histocompatibilidade Menor (MiHA) que desencadeiam uma forte resposta do sistema imune adquirido ao órgão transplantado. Hoje os fármacos utilizados obtêm grande sucesso em suprimir esta resposta e manter a sobrevida do enxerto, mas as custas de diversas patologias secundarias. Com o objetivo em suprimir a resposta do sistema imune adquirido ao MiHA especificamente o HY, utilizamos um protocolo de tolerância oral, visando manter a sobrevida do enxerto e evitar as complicações secundarias, através da especificidade ao antígeno. Foi utilizado um protocolo de Terapia Combinada (TC) (extrato do baço do doado + bactéria L. Lactis) em modelo de transplante de pele em camundongos C57BL/6. Os animais machos foram os doadores e as fêmeas as receptoras. A TC foi administrada por um período de 4 dias consecutivos. Primeiro avaliamos a dose/resposta da terapia combinada, foi administrado diferentes doses para os animais (50μg/ml, 5μg/ml e 0,5μg/ml) em conjunto com L.Lactis. Os animais tratados tiveram uma sobrevida contínua e não tratado perdeu o enxerto. Todas as doses foram eficientes na manutenção da sobrevida do enxerto, demonstrando desta forma a eficácia da terapia combinada. Depois analisamos quais células estariam envolvidas na indução da sobrevida do enxerto. Vinte dias após o Tx os animais foram sacrificados e as células foram analisadas, os animais tratados, apresentaram uma frequência elevada de duas populações de células Treg (CD4+CD25+Foxp3+ e CD4+CD25-Foxp3+) na pele em comparação ao não tratado. Confirmando assim o efeito protetor para a sobrevida do Tx dos animas tratados. Partindo deste resultado, foi necessário caracterizar quais células seriam responsáveis para induzir as Treg na pele. Após um período de 20 dias ao Tx os animais foram sacrificados e realizada a análise das células do baco e linfonodo mesentérico. Das analises realizadas, não foi encontrado nenhuma diferença significativa na população de células dendríticas no linfonodo mesentérico e baço. Já que a as células dendríticas foram descartadas, a segunda opção como apresentadora de antígeno seria a célula B, tendo como base os resultados publicados por Mercadantes et al. (2014). Foi realizado um experimento após 20 dias XII ao Tx, os animais foram sacrificados e seu baço e linfonodo mesentérico analisado. Os resultados demonstraram elevada população de células B transicional, sendo estas as possíveis células que estariam induzindo as populações de células Tregs. Logo após foi realizado um experimento para analisar a relevância do linfonodo mesentérico na terapia combinada. Os animais foram nefrectomizados e os depois tratados com a terapia combinada. A ausência do linfonodo mesentérico levou a rejeição do enxerto dos animais tratados. Conclui-se que esta terapia combinada induz a tolerância oral, os linfócitos B transicionais parecem ter uma participação relevante neste fenômeno e que o linfonodo mesentérico é fundamental para este mecanismo de indução.

Palavras-chave: transplante de pele; LLactis; histocompatibilidade

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Envolvimento do metabolismo do citrato nas funções leishmanicidas de macrófagos.

Título: Envolvimento do metabolismo do citrato nas funções leishmanicidas de macrófagos.
Aluno(a): Lara Kauss
Orientador(es): Prof(a). Heitor Affonso de Paula Neto

As leishmanioses são consideradas endêmicas em mais de 80 países, onde cerca de 2 milhões de casos e 7 mil mortes são reportados todos os anos, tornando-a uma das mais importantes dentre as doenças tropicais negligenciadas. As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania, que mantem seu ciclo de vida entre um hospedeiro mamífero e um vetor invertebrado. A eliminação dos parasitos intracelularesdepende da ativação dos mecanismos efetores dos macrófagos, especialmente a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (EROs). Estudos recentes demonstraram um importante papel do metabolismo de citrato para a produção desses mediadores por macrófagos ativados in vitro com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) e interferon-γ (IFN-γ).De acordo com esses estudos, o metabolismo de citrato serviria como fonte importante de NADPH, um co-fator para a produção de EROs e NO. No entanto, a participação dessa via metabólica para a produção desses mediadores e a eliminação de patógenos intracelulares em um modelo de infecção nunca foi testado. O objetivo de nosso estudo foi, portanto, avaliar a contribuição do metabolismo de citrato para a função leishmanicida de macrófagos. Além disso,nos propusemos a testar se a adição de citrato exógeno seria capaz de potencializar a eliminação de leishmania por macrófagos infectados. Nossos resultados demostraram que a inibição farmacológica da enzima ATP-citrato liase (ACYL), uma enzima chave da via metabólica do citrato, aumentousignificativamente a porcentagem de infecção e o número de parasitos intracelulares em macrófagos infectados. O tratamento também reduziu significativamente a produção de NO pelos macrófagos, demonstrando a importância da via metabólica do citrato na função leishmanicida dos macrófagos. Em adição, testamos a participação da via das pentoses nesse processo, uma vez que essa via é classicamente uma fonte de NADPH. A inibição da enzima chave da via das pentoses, a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) com o inibidor 6-AN (6-aminonicotinamida), aumentou significativamente a porcentagem e o número de leishmanias nos macrófagos infectados e reduziu drasticamente a produção de NO, sugerindo que essa via é mais relevante para a produção desse mediador.Por fim, nossos resultados sugerem que a suplementação com citrato exógeno é capaz de reduzir a porcentagem de infeção e o número de parasitos nos macrófagos infectados, além de aumentar a produção de NO. Em conjunto, nossos dados mostram, pela primeira vez, a relevância da via metabolica do citrato para a função leishmanicida de macrófagos e ainda sugerem que a adição de citrato pode auxiliar na eliminação de parasitos por essas células.

Palavras-chave: macrófagos; Leishmania amazonensis; Leishmania major; ATP-citrato liase; glicose-6-fosfato desidrogenase; óxido nítrico

Leishmaniases are considered endemic diseases in over 80 countries, where 2 million cases and 7 thousand deaths are reported every year, being recognized as one of the most important tropical neglected diseases.These diseases are caused by protozoans of the Leishmania genre, which keep their life cycles between a mammal host and an invertebrate vector. Intracellular parasite elimination depends upon the activation of effector mechanisms of macrophages, especially nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production. Recent studies have shown animportant role for citrate metabolism in the production of these mediators by macrophages activated in vitro with bacterial lipopolysaccharide (LPS) and interferon-γ (IFN-γ). According to these studies, citrate metabolism would provide a source for NADPH, a co-factor for the production of both NO and ROS. However, the involvement of this metabolic pathway in the production of these mediators and the elimination of intracelular pathogens in an infection model has never been tested. Our aim was, therefore, to evaluate the contribution of citrate metabolism to the leishmanicidal functions of macrophages. Additionally, we tested whether exogenous citrate would potentiate the elimination of leishmania by infected macrophages. Our results show that the pharmacological inhibition of ATP-citrate lyase (ACLY), a key enzyme of citrate metabolism, significantly increased the percentage of infected macrophages and the number of intracellular parasites. This treatment also reduced NO production, demonstrating the importance of citrate metabolism to the leishmanicidal functions of macrophages.In addition, we tested the participation of the pentose-phosphate shunt (PPP) in this process, since this is a metabolic pathway classically involved in NADPH production. Inhibition of the key PPP enzyme, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) with 6-AN (6-aminonicotinamide), significantly increased the percentage of infected macrophages and the number of leishmania, with a drastic reduction in NO production, suggesting a more relevant role for this pathway in this process. Finally, our results suggest that exogenous citrate is able to reduce the percentage of infected macrophages as well as the number of parasites per macrophage, with a concomitant increase in NO production. Taken together, our data show for the first time the relevance of citrate metabolism for the leishmanicidal functions of macrophages and also suggest that citrate supplementation may help in parasite elimination by these cells.

Keyword: macrophages; Leishmania amazonensis; Leishmania major; ATP-citrate lyase; glucose-6-phosphate dehydrogenase; nitric oxide

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Avaliação do perfil de células t regulatórias em diferentes linhagens de camundongos e sua implicação na resposta alérgica pulmonar.

Título: Avaliação do perfil de células t regulatórias em diferentes linhagens de camundongos e sua implicação na resposta alérgica pulmonar.
Aluno(a): Carolina Trindade de Azevedo
Orientador(es): Prof(a). Priscilla Christina Olsen

As células T regulatórias (Tregs) são importantes na proteção contra respostas a antígenos inócuos, como os alérgenos, controlando a resposta Th2, mecanismo que parece comprometido em indivíduos asmáticos. Diferentes linhagens de camundongos isogênicos também apresentam distintas respostas imunológicas e particularidades na suscetibilidade aos variados protocolos experimentais. Neste trabalho investigaram-se as diferenças na frequência dos subtipos de células Treg entre as linhagens A/J, BALB/c, e C57BL/6, em condições normais e mediante indução de asma alérgica com ovoalbumina (OVA). Duas sensibilizações subcutâneas de uma solução contendo 50 μg de OVA e 5 mg de alúmen nos dias 0 e 14 e desafios intranasais nos dias 19, 20, 21 e 22 com uma solução de OVA (25 μg/25 μL de salina) induziram alterações características do quadro asmático como hiperreatividade das vias aéreas, inflamação e produção de citocinas Th2 (IL-4, IL13, IL-5 e IL-33) no pulmão somente nas linhagens A/J e BALB/c, avaliados por pletismografia de corpo inteiro invasiva, citometria e ELISA, respectivamente. C57BL/6 apresentou maior frequência de células Treg CD4+CD25+ Foxp3+ no BAL e no linfonodo mediastinal (mLN) após desafio com OVA. O estímulo antígeno-específico in vitro de células do mLN de animais desafiados com OVA induziu maior produção de células Treg CD4+ IL-10+ pela linhagem A/J, e CD4+CD25+ Foxp3+ por C57BL/6. A linhagem A/J também apresentou naturalmente maior frequência de células CD4+ IL-10+ no pulmão de camundongos que nunca foram sensibilizados nem desafiados, comparada às demais linhagens, acompanhada de maiores frequências de células CD4+ IL-4 + . As diferenças observadas quanto às frequências dos subtipos de células Treg associadas à suscetibilidade dos animais avaliados à asma experimental sugerem que células Treg CD4+CD25+ Foxp3+ e CD4+ produtoras de IL-10 podem exercer diferentes papéis no controle da asma, visto que níveis elevados de células CD4+ IL-10+ foram incapazes de proteger camundongos A/J desafiados com OVA da inflamação alérgica pulmonar, enquanto maiores frequências de células CD4+CD25+ Foxp3+ em camundongos C57BL/6 parecem protegê-los efetivamente. De forma semelhante aos indivíduos asmáticos, a falta de uma resposta reguladora eficiente e a suscetibilidade ao desenvolvimento de asma experimental dos camundongos A/J sugerem ainda que esta linhagem deve ser preferencialmente escolhida em modelos experimentais de asma. Palavras chave: asma;, alergia; células T regulatórias; inflamação;
Palavras-chave: asma; alergia; células T regulatórias; inflamação

Regulatory T cells (Tregs) are important in protecting against responses to innocuous antigens, such as allergens, by controlling the Th2 response, a mechanism that appears to be compromised in asthmatic individuals. Different isogenic mouse strains also have distinct immunological responses and susceptibility to the experimental protocols used to develop lung allergic inflammation. In this work we investigated the differences in the frequence of Treg cell subtypes between A/J, BALB/c, and C57BL/6, under normal conditions and through induction of allergic asthma with ovalbumin (OVA). Two subcutaneous sensitizations of a solution containing 50 μg of OVA and 5 mg of alum on days 0 and 14 and intranasal challenges on days 19, 20, 21 and 22 with OVA solution (25 μg/25 μl of saline) induced asthma characteristic changes such as airway hyperreactivity, inflammation and production of Th2 cytokines (IL-4, IL-13, IL-5 and IL-33) in the lungs only in the A/J and BALB/c strains, evaluated by invasive whole body plethysmography, cytometry and ELISA, respectively. C57BL/6 presented higher frequency of CD4+CD25+ Foxp3+ Treg cells in BAL and mediastinal lymph node (mLN) after the OVA challenge. In vitro antigen-specific stimulation of mLN cells from OVA-challenged animals induced higher production of CD4+ IL-10+ Treg cells by A/J strain, and CD4+CD25+ Foxp3+ by C57BL/6. A/J strain also naturally showed a higher frequency of CD4+ IL-10+ cells in the lungs of naive mice compared to the other strains, accompanied by higher frequencies of CD4+ IL-4 + cells. The observed differences in the frequencies of Treg cell subtypes associated with the susceptibility of the animals to experimental asthma suggest that CD4+CD25+ Foxp3+ and IL-10-producing CD4+ Treg cells may play different roles in asthma control, since elevated levels of CD4+ IL-10+ cells were unable to protect OVA-challenged A/J mice from lung allergic inflammation, while higher frequencies of CD4+CD25+ Foxp3+ cells in C57BL/6 mice appear to effectively protect them. Similar to asthmatic individuals, the lack of an efficient regulatory response and susceptibility to the development of experimental asthma in A/J mice further suggests that this strain should preferably be chosen in experimental models of asthma. Key words: asthma; allergy; regulatory T cells; inflammation;

Keyword: asthma; allergy;regulatory T cells; inflammation

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O papel da disfunção mitocondrial na ativação do inflamassomo em resposta ao fungo patogênico aspergillus fumigatus.

Título: O papel da disfunção mitocondrial na ativação do inflamassomo em resposta ao fungo patogênico aspergillus fumigatus.
Aluno(a): Alexander Goncalves da Silva
Orientador(es): Prof(a). Rodrigo Tinoco Figueiredo

Os fungos filamentosos do gênero Aspergillus spp incluem diversas espécies capazes de causar infecções humanas. Particularmente, a espécie A. fumigatus, que se constitui no principal agente causador de infecções pulmonares invasivas, é um dos principais agentes causadores de infecções pulmonares invasivas em pacientes imunosuprimidos, e estas infecções apresentam altas taxas de mortalidade. Do reconhecimento e controle do fungo participam receptores da imunidade inata, como Dectina-1 e o complexo inflamassomo Nlrp3, que é responsável pela secreção de citocinas como a IL-1β. A ativação do inflamassomo Nlrp3 pode ocorrer em função de diversos estímulos, como RNA bacteriano, ATP extracelular, ou cristais de ácido úrico. Danos na mitocôndria são sugeridos como uma das formas da liberação de ROS mitocondrial para a ativação do inflamassomo. Este trabalho teve como objetivo observar o papel da disfunção mitocondrial na liberação de ROS mitocondrial e ativação do inflamassomo Nlrp3, frente ao estímulo de macrófagos murinos com A. fumigatus. Macrófagos peritoneais murinos obtidos de camundongos selvagens ou Clec7a-/- (knockouts para Dectina-1) foram estimulados com conídios de A. fumigatus e a viabilidade mitocondrial foi observada através da microscopia confocal, que também foi utilizada para observar se ocorre perda da viabilidade mitocondrial quando o fungo não está mais vivo e se ROS mitocondrial causariam essa perda. Mensuramos a liberação de ROS mitocondrial por meio da técnica de citometria de fluxo e testamos se a inibição de ROS mitocondrial causaria uma diminuição da secreção de IL-1β, utilizando ELISA. Observamos que macrófagos peritoneais Clec7a-/- não apresentaram despolarização da membrana mitocondrial após a estimulação com conídios de A. fumigatus, ao contrário dos controles wild type. Observamos ainda a liberação de ROS mitocondrial após a perda do potencial de membrana mitocondrial. A secreção de IL-1β não foi estimulada na ausência de ROS mitocondrial. Os resultados sugerem que o receptor Dectina-1 reconhece o A. fumigatus, causando a disfunção mitocondrial, o que fará com que ocorra a liberação de ROS mitocondrial, que será o sinal responsável pela ativação do inflamassomo Nlrp3, ocasionando a secreção de IL-1β.

Palavras-chave: Aspergillus fumigatus;Inflamassomos;Mitocôndria-Imunologia;Mitocôndria-Patologia

The filamentous fungi of the genus Aspergillus spp include several species capable of causing human infections. Particularly, the species A. fumigatus, which is the main agent causing invasive pulmonary infections, is one of the main agents of invasive pulmonary infections in immunosuppressed patients, and these infections have high mortality rates. As a form of recognition and control of the fungus, recognition is performed through receptors of innate immunity, including Dectin-1 and the inflammatory complex Nlrp3, the latter responsible for the secretion of cytokines such as IL-1β. Activation of Nlrp3 inflammasome can occur due to several stimuli, such as bacterial RNA, extracellular ATP, uric acid crystals, among others. Damage to mitochondria is suggested as one of the forms of mitochondrial ROS release for the activation of inflammasome. This work aimed to observe the role of mitochondrial dysfunction in the release of mitochondrial ROS and activation of Nlrp3 inflammasome in response to the stimulation of murine macrophages with A. fumigatus. Murine peritoneal macrophages obtained from wild mice or Clec7a-/- (Dectin-1 knockouts) were stimulated with A. fumigatus conidia and mitochondrial viability was observed by confocal microscopy, which was also used to observe whether loss of mitochondrial viability occurs when the fungus is no longer alive and also whether mitochondrial ROS would cause such loss. We measured the release of mitochondrial ROS by means of the flow cytometry technique and analyzed whether the inhibition of mitochondrial ROS would cause a decrease in the secretion of IL-1β by use of the ELISA technique. We observed that Clec7a-/- peritoneal macrophages do not exhibit mitochondrial membrane depolarization. Mitochondrial ROS was released upon loss of mitochondrial membrane potential and Il-1β secretion was not stimulated in the absence of mitochondrial ROS. These results suggest that the Dectin-1 receptor recognizes A. fumigatus, causing mitochondrial dysfunction, which will cause the release of mitochondrial ROS, which will be the signal responsible for the activation of the Nlrp3 inflammasome, leading to the secretion of IL-1β.

Keyword: Aspergillus fumigatus;Inflammasomes;Mitochondria-Immunology;Mitochondria-Patology

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O papel dos receptores PD-1/PD-L1 e o uso de imunoterapias com anti-PD-1 e anti-PDL-1 contra Leishmania amazonensis.

Título: O papel dos receptores PD-1/PD-L1 e o uso de imunoterapias com anti-PD-1 e anti-PDL-1 contra Leishmania amazonensis.
Aluno(a): Alessandra Marcia da Fonseca Martins
Orientador(es): Prof(a). Elvira Maria Saraiva Chequer Bou Habib

O receptor PD-L1 (Programmed death-ligand 1) é encontrado em células apresentadoras de antígenos como células dendríticas, macrófagos e neutrófilos e PD-1 é expresso em linfócitos. A formação do complexo PD-L1/PD-1 pode induzir a supressão de células T e anticorpos específicos contra essas moléculas revertem o quadro de supressão. Nosso estudo buscou avaliar a possibilidade de uma nova terapia contra a leishmaniose cutânea com o uso de anticorpos monoclonais como anti-PD-1 e anti-PD-L1. Sabemos que a leishmaniose é uma doença negligenciada e que a Leishmania amazonensis é o agente etiológico da leishmaniose cutânea, bem como de formas mais graves e de difícil tratamento como a difusa e visceral. A imunoterapia que usamos, demonstrou resultados promissores por possibilitar o controle da carga parasitária tanto na pata infectada do camundongo quanto no baço e linfonodo. Além disso, nós sugerimos que o mecanismo principal gerador desse controle é o aumento de células T CD8+ produtoras de IFN-ɤ. Também avaliamos a expressão de PD-L1 em neutrófilos murinos e humanos infectados por promastigotas e amastigotas de L. amazonensis. Nossos dados revelaram que a taxa de infecção é similar em neutrófilos murinos infectados com amastigotas e promastigotas, no entanto, em neutrófilos humanos promastigotas são mais infectivos. Quanto à expressão de PD-L1, amastigotas estimulam a expressão de PD-L1 em cerca de 90% dos neutrófilos murinos e 8% dos humanos. Promastigotas estimulam 40% de expressão de PD-L1 em neutrófilos murinos e em torno de 1% em humanos. Ressaltamos que neutrófilos não infectados apresentam taxas basais de expressão de PD-L1. Esses resultados nos sugerem que L. amazonensis consegue subverter a resposta imune através da indução da expressão de PD-L1 em neutrófilos e, consequentemente, a supressão da célula T efetora.

Palavras-chave: PD-L1; Leishmania amazonensis; Neutrófilo

The PD-L1 receptor (Programmed death-ligand 1) is found in antigen-presenting cells such as neutrophils, macrophages and dendritic cells and PD-1 is expressed on lymphocytes. The formation of the PD-L1/PD-1 complex can induce T-cells suppression and specific antibodies against those molecules reverse the suppression. Our study aimed to evaluate the possibility of a new therapy against cutaneous leishmaniasis with the use of monoclonal antibodies such as anti-PD-1 and anti-PD-L1. We know that leishmaniasis is a neglected disease and that Leishmania amazonensis is the etiological agent of cutaneous leishmaniasis, as well as of the more severe forms such as diffuse and visceral, which are more difficult to treat. The immunotherapy we used has shown promising results because it allows the control of the parasite load in the infected mouse paw, spleen and lymph node. In addition, we suggested the main mechanism that generates this control involved the increase of IFN-ɤ producing T CD8+ cells. We also evaluated the expression of PDL1 in murine and human neutrophils infected with promastigotes and amastigotes of L. amazonensis. Our data revealed that the infection rate is similar in murine neutrophils infected with amastigotes and promastigotes, however, in human neutrophils promastigotes are more infective. As for PD-L1 expression, amastigotes stimulate PD-L1 expression in about 90% of murine neutrophils and 8% of humans. Promastigotes stimulate 40% PD-L1 expression in murine neutrophils and around 1% in humans. Remarkably, uninfected neutrophils have basal rates of PD-L1 expression. These results suggest that L. amazonensis is able to subvert the immune response by inducing PD-L1 expression in neutrophils and, consequently, suppressing effector T-cells. Key-words:

Keyword: Leishmania amazonensis; Neutrophil; PD-L1

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2016

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Papel da mioglobina na resposta imune inata no modelo de rabdomiolise em camundongos.

Título: Papel da mioglobina na resposta imune inata no modelo de rabdomiolise em camundongos.
Aluno(a): Andreza Moreira dos Santos Gama
Orientador(es): Prof(a). Marcelo Torres Bozza

A mioglobina é uma proteína ligadora de oxigênio presente em células musculares. Contém uma única cadeia polipeptídica de 153 aminoácidos de sequência conhecida e um único grupo ferro-porfirina ou heme. Esta proteína é a principal nefrotoxina associada ao dano na rabdomiólise. Os mecanismos propostos para sua toxicidade incluem obstrução tubular, injúria oxidativa, vasoconstrição, apoptose e inflamação. A mioglobina induz a expressão de moléculas de adesão, de fatores de transcrição como AP-1 e NFκB e de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-1β. Outro efeito descrito da mioglobina é o estresse oxidativo, no qual, a mioglobina após ser endocitada pelos túbulos proximais, pode passar de seu estado ferroso para férrico, resultando na peroxidação lipídica. A presença de mioglobina nos túbulos renais aumenta a expressão de HO-1, indicando possível papel do ferro do heme nesse processo. O heme livre é uma molécula pró- oxidante e pró-inflamatória, capaz de induzir a geração de EROs e de secreção de diversas citocinas. Exerce parte de seus efeitos ativando o receptor TLR4 em macrófagos na ausência de soro. No presente estudo nós mostramos que a mioglobina induziu a secreção de TNFα em macrófagos na ausência e presença de soro, e ainda na presença de albumina. Em macrófagos a mioglobina: induziu a secreção de TNF-α e citotoxicidade dependente de TLR4; induziu a secreção de RANTES, sugerindo a ativação da via de TRIF; ativou inflamassoma como primeiro sinal; ativou a enzima tirosina quinase SYK e foi capaz de induzir TNFα independentemente da geração de EROs. Nos experimentos in vivo, nós mostramos que no modelo experimental de rabdomiólise induzida por glicerol foi possível detectar a expressão de TN-Fα no plasma e IL-1β nos rins. Além disso, a letalidade causada por rabdomiólise foi dependente de TLR4 e MyD88. Esse conjunto de resultados sugerem que a mioglobina exerce parte de seus efeitos nocivos ativando receptores da imunidade inata e que esses receptores podem estar envolvidos como possíveis mecanismos na patogênese rabdomiólise.

Palavras-chave: Célula B-1, Rabdomiólise; Mioglobina; Heme; TLR4; Macrófagos; Espécies Reativas de Oxigênio (EROs); TNF-α; RANTES

Myoglobin is an oxygen binding protein present in muscle cells. It contains a single polypeptide chain of 153 of known sequence aminoacids and a single iron porphyrin or heme group. This protein is the main nephrotoxin associated with damage to rhabdomyolysis. The mechanisms proposed for toxicity include tubular obstruction, oxidative injury, vasoconstriction, apoptosis and inflammation. Myoglobin induces the expression of adhesion molecules, transcription factors such as AP-1 and NFκB and proinflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β. Another myoglobin described effect is the oxidative stress, wherein the myoglobin after being endocytosed by the proximal tubule, can move from its ferrous to ferric state, resulting in lipid peroxidation. The presence of myoglobin in renal tubules increases the expression of HO-1, heme iron indicating a possible role in this process. Free heme is a pro-oxidant and proinflammatory molecule capable of inducing ROS generation and secretion of various cytokines. Exerts part of its effects by activating the TLR4 receptor on macrophages in the absence of serum. We investigated that myoglobin induced not only the secretion of TNF-α in macrophages in the absence and presence of serum but also in the presence of albumin. Myoglobin In macrophages: induced TNF-α secretion and TLR4-dependent cytotoxicity; induced secretion of RANTES suggesting the activation of the TRIF pathway; activated inflammasome as the first signal; activated SYK tyrosine kinase enzyme, and was able to induce TNF-α regardless of ROS generation. In in vivo experiments, we demonstrate that the experimental model of glycerol-induced rhabdomyolysis was possible to detect the expression of TNF-α in plasma and IL-1β in the kidneys. Furthermore, the lethality caused by rhabdomyolysis is dependent on TLR4 and MyD88. As a result, the present investigation suggests that part of myoglobin exerts its harmful effects by activating receptors of the innate immunity and that these receptors might be involved in the pathogenesis and possible mechanisms rhabdomyolysis.

Keyword: Rabdomyolysis; Myoglobin; Heme; TLR4; Macrophages; ROS; TNF-α; RANTES

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Indução de aggresome-like induced structures (alis) em macrófagos murinos pelo heme e seus produtos de degradação.

Título: Indução de aggresome-like induced structures (alis) em macrófagos murinos pelo heme e seus produtos de degradação.
Aluno(a): Ellen Kiarely de Souza
Orientador(es): Prof(a). Leonardo Holanda Travassos Correa

Aggresome-like induced structures (ALIS) são agregados de proteínas poli ubiquitinadas formados em diversos tipos celulares em resposta a um estímulo bacteriano (LPS) e/ou decorrentes de diferentes tipos de estresse celular geradores de sinais de dano que acarretam o acúmulo de proteínas ubiquitinadas. Nesse trabalho, demonstramos que ALIS podem ser induzidos em macrófagos murinos pela molécula hemeprotoporfirina IX, uma vez que esta induz a co-localização de p62 e ubiquitina. Demonstramos também o importante papel da heme oxigenase (HO-1) e da degradação do heme na formação de ALIS. Demonstramos ainda que o ferro e o fator de transcrição Nrf2 são essenciais para formação de ALIS. Além disso, a ferritina desempenha um papel essencial da proteína ferritina na diminuição do número dessas estruturas. Finalmente, observamos em fibroblastos (MEFs ATG 5 -/- ), deficientes em autofagia, um aumento dessas estruturas em comparação aos fibroblastos selvagens, mostrando assim que os ALIS são degradados pela via autofágica

Palavras-chave: ALIS. Ferro. Macrófagos. Agregados de proteínas. HO-1

Aggresome-like induced structures (ALIS) are aggregates that contain polyubiquitinated proteins, formed in various cell types. These structures arise in response to a bacterial stimulus (LPS) or different kinds of cellular stress, which signal damage, causing accumulation of ubiquitined proteins. In this study, we show that in murine macrophages, the formation of ALIS is induced upon stimulation with heme protoporphyrin IX, as evidenced by the co-localization of p62 and ubiquitin. We also demonstrated the important role of heme oxygenase (HO-1) and the degradation of heme in the formation of ALIS. We also demonstrated that iron is essential for the formation of these structures, which are also dependent on the transcription factor Nrf2. We show the essential role of the protein ferritin in reducing these structures. Finally, we observed in fibroblast (MEFs ATG cells 5 - / - ), deficient in autophagy an increase of these structures compared to wild type fibroblasts, suggesting that the ALIS are degraded by autophagic pathway.

Keyword: ALIS. Iron. Macrophage. Aggregates of proteins. HO-1.

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O impacto da terapia com célula tronco mesenquimal (MSC) na infecção por Leishmania ssp.

Título: O impacto da terapia com célula tronco mesenquimal (MSC) na infecção por Leishmania ssp.
Aluno(a): Joyce Carvalho Pereira
Orientador(es): Prof(a). Herbert Leonel de Matos Guedes

A terapia celular tem como função restabelecer a estrutura e a função de um tecido através da utilização de uma célula ou de um grupo de populações celulares. Contra a leishmaniose ainda não há vacinas aprovadas, a quimioterapia é inadequada, pois há efeitos adversos e até o momento não existe uma terapia ideal e funcional. Neste trabalho, avaliamos o potencial, empregando células tronco mesenquimais (MSC) contra a leishmaniose cutânea e visceral murinas. No experimento in vitro, verificou-se que as MSCs não são infectadas pela Leishmania amazonensis. No entanto, a co-cultura de macrófagos infectados com MSC aumentou a carga parasitária em comparação com o controle (macrófago sem MSC). No experimento de leishmaniose cutânea murina, camundongos BALB/c foram infectados com 2x106 promastigotas de L. amazonensis (cepa Josefa) no coxim plantar da pata direita. Sete dias após a infecção, os animais foram tratados com 1x105 MSCs pela via intralesional (i.l.), ou seja, no mesmo local da infecção, ou pela via intravenosa (i.v.), na veia jugular externa. Animais controles receberam o mesmo volume (50µl) de PBS por vias i.l. ou i.v. Trinta dias após o primeiro tratamento, os animais receberam uma segunda administração de MSC. O perfil clínico da doença foi verificado pelo desenvolvimento da lesão, através da medida da espessura por paquimetria. Quarenta e dois dias após a infecção, os animais foram eutanasiados. A carga parasitária da pata e do linfonodo drenante foram quantificados pela técnica de diluição limitante (LDA). As células do linfonodo e baço foram avaliadas por citometria de fluxo para caracterização dos fenótipos celulares. O tratamento com MSC pela via i.v. induziu um pequeno agravamento da lesão. Os animais tratados com MSC i.v. apresentaram diferença significativa na carga parasitária da pata em relação ao seu controle e, a análise do perfil celular dos linfonodos, mostrou aumento de células T efetoras e T reguladoras nos animais. No baço, foi observado um aumento de células T reguladoras e da produção de IL-10 por células TCD4+ e TCD8+ e, na pata, também observamos um aumento de IL-10. A produção excessiva de IL-10 pode estar associada ao efeito de agravamento da doença pela terapia com MSC pela via i.v. No entanto, não foi observado qualquer efeito prejudicial no tratamento i.l. Nossos resultados demonstraram que as MSCs não contribuem para o controle da infecção. No experimento de leishmaniose visceral, camundongos BALB/c foram infectados com 1x107 promastigotas de L. infantum/chagasi pela via i.v. na cauda. A administração do tratamento com MSC i.v. (veia jugular externa) foram dadas 5 e 12 dias após a infecção. Após 30 dias os animais foram eutanasiados, a carga VIII parasitária do baço e do fígado foram quantificados por LDA. Ambos os órgãos apresentaram carga parasitária, porém sem diferença significativa entre os animais tratados com MSC em relação ao seu controle, mostrando que o tratamento não foi eficaz. Tomando em conjunto, nossos dados sugerem que o tratamento com MSC pode ter efeitos deletérios na leishmaniose cutânea e visceral murina

Palavras-chave: Leishmaniose; Leishmania amazonensis; Leishmania Infantum/chagasi; Célula Tronco Mesenquimal

Cell therapy aims at restoring tissue structure and functionality through the use of a cell or a subpopulation of cells. For leishmaniasis there are still no approved vaccines, available chemotherapy is inadequate as there are side effects and, so far, there is no ideal and functional therapy. In this study, we evaluated the potential application of mesenchymal stem cells (MSC) treatment against murine cutaneous and visceral leishmaniasis. In vitro, we found that MSCs are not infected by Leishmania amazonensis. However, co-culture of infected macrophages with MSC increased parasite load on macrophages in comparison to controls (macrophage without MSC). In murine cutaneous leishmaniasis, BALB/c mice were infected with 2x106 L. amazonensis (strain Josefa) promastigotes in the footpad of the right paw. Seven days after infection, animals were treated with 1x105 MSCs, either intralesional (i.l.), i.e. in the same site of infection, or intravenously (i.v.), through the external jugular vein. Control animals received the same volume (50 µl) of PBS by routes i.l. or i.v. Thirty days after the first treatment, animals received a second administration of MSC. The clinical profile of the disease was checked by lesion development through the thickness measured by pachymetry. Forty-two days after infection, animals were euthanized. Parasite burden in the paw and in the draining lymph nodes were quantified by limiting dilution technique (LDA). Lymph node and spleen cells were phenotyped by flow cytometry. Intravenous treatment with MSC resulted in a small worsening of the injury. The animals treated with MSC i.v. presented a significant difference in parasite load in comparition with your controls and, the cellular profile analysis of lymph nodes showed an increase in effector and regulatory T cells in animals. Increased number of regulatory T cell and IL-10 producing T CD4+ and TCD8+ cells in the spleen, and upregulation of IL-10 in the footpad. The excessive production of IL-10 could be associated to the diseaseaggravating effects of MSC therapy by the i.v. route. On the other hand, it was not observed any harmful effect on i.l. treatment. Our results showed that stem cells do not contribute to the infection control in cutaneous leishmaniasis. In the experiment of visceral leishmaniasis, BALB/c mice were infected with 1x107 promastigotes of L. infantum/chagasi by i.v. route in tail. Administration of treatment with MSC i.v. (jugular vein) was injected in 5 and 12 days after infection. After 30 days, animals were euthanized, the parasitic load of spleen and liver were quantified by LDA. Both organ showed parasitic load, but with no significant difference between the animals treated MSCs compared to their controls, showing that the treatment was not effective. Having together, our data X suggest that treatment with MSC may have deleterious effects on murine cutaneous and visceral leishmaniasis.

Keyword: Leishmaniasis; Leishmania amazonensis; Leishmania infantum / chagasi; Mesenchymal stem cell

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Caracterização do impacto estimulatório do ácido nordihidroguaiarético (NDGA) no metabolismo lipídico de macrófagos.

Título: Caracterização do impacto estimulatório do ácido nordihidroguaiarético (NDGA) no metabolismo lipídico de macrófagos.
Aluno(a): Maria Nathalia de Lira
Orientador(es): Profa. Christianne Bandeira de Melo

Os macrófagos desempenham um papel central na interface entre a imunidade inata e adaptativa, tornando se alvos de diversos estudos. O NDGA é uma molécula que possui diversos mecanismos de ação ainda não muito bem elucidados. Em macrófagos murinos, o NDGA é capaz de promover rápida liberação de ATP através da panexina-1, produz um influxo de cálcio e dispara um mecanismo de captura de corantes catiônicos. Neste trabalho buscamos entender como o NDGA, que dentre vários mecanismos de ação, é principalmente descrito como inibidor da enzima 5-LO, afeta os corpúsculos lipídicos, o principal compartimento intracelular de síntese de eicosanoides. Neste estudo utilizamos macrófagos peritoneais murinos estimulados com NDGA 50 µM com tempos de incubação variados, e avaliamos o influxo de cálcio, liberação de ATP, produção de mediadores lipídicos e o conteúdo citoplasmático de corpúsculos lipídicos. Nosso estudo caracterizou que o NDGA é capaz de diminuir a quantidade de corpúsculos lipídicos do citoplasma de macrófagos murinos de forma rápida e duradoura (perdura por no mínimo 24 h). Além disso, o rápido desaparecimento é acompanhado de uma diminuição específica da secreção do prostanoide TXB2, sem afetar a síntese de outros eicosanoides em até 10 min de estimulação, incluindo os metabólitos da 5-LO, o cys-LT. O efeito sobre a quantidade de corpúsculos lipídicos também ocorre em macrófagos ativados com LPS e, pelo menos, em mais um tipo celular, os eosinófilos. O mecanismo de ação envolvido no desparecimento de corpúsculos lipídicos induzido por NDGA não envolve a modulação da via da 5-LO, intermediação por PGD2, ou uma atividade autócrina/parácrina por ATP secretado, visto que (i) outros inibidores da enzima 5-LO não reproduzem os efeitos do NDGA; (ii) o inibidor da H-PGDS não afeta os efeitos do NGDA em macrófagos; e (iii) ao degradarmos o ATP liberado com apirase ou ao impedirmos sua liberação via panexina-1 com o uso do carbenoxolone, o efeito de desaparecimento de corpúsculos lipídicos ainda é preservado. Parte do mecanismo envolvido no efeito do NDGA para a rápida degradação de corpúsculos lipídicos parece estar associado a uma ativação de proteossoma, visto que seu inibidor clássico, o bortezomib, impede a rápida diminuição tanto do número destas organelas como da síntese de TXB2 induzida por NDGA. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar o rápido efeito de degradação de corpúsculos lipídicos em macrófagos pela ação do NDGA com a participação do proteossoma. No entanto, estudos complementares fazem-se necessários para melhor entender o impacto dessa diminuição abrupta de corpúsculos lipídicos na fisiologia da resposta imune no contexto de doenças inflamatórias e distúrbios neuro-imuno-endocrinos

Palavras-chave: macrófago; NDGA; corpúsculos lipídicos; proteossoma

Macrophages play a central role in the interface between innate and adaptive immunity, making it the target of several studies. The NDGA is a molecule that has multiple mechanisms of action not yet well understood. In murine macrophages, the NDGA is able to promote rapid release of ATP by pannexin-1, produces calcium influx and triggers a dye uptake mechanism. In this work we understand how NDGA which of several mechanisms action is mainly described as an inhibitor of 5-LO enzyme, affects the lipid bodies, the main intracellular compartment of eicosanoid synthesis. In this study, we used murine peritoneal macrophages stimulated with NDGA 50 µM with varying incubation times and evaluated calcium influx, ATP release, production of lipid mediators, and the cytoplasmic contents of lipid body. Our study characterized that NDGA is able to decrease the amount of lipid bodies in the cytoplasm of murine macrophages (lasting for at least 24 h). Furthermore, the rapid disappearance is accompanied by a specific reduction in TXB2 prostanoid secretion without affecting the synthesis of the other eicosanoids at least 10 min of stimulation, including the metabolites of 5-LO, the cys-LT. The effect on the amount of lipid bodies also occurs in macrophages activated with LPS and at least in another cell type, eosinophils. The mechanism of action involved in the disappearance of lipid bodies induced by NDGA does not involve: modulation of the 5-LO, intermediation of PGD2 or an autocrine/paracrine ATP secreted activity, as: (i) other inhibitors of 5-LO enzyme do not reproduce the effects of NDGA; (Ii) H-PGDS inhibitor does not affect the effects of NDGA in macrophages; and (iii) the degradation of released ATP with apyrase or preventing of its release via panexina-1 with the use of carbenoxolone, the disappearance of lipid body effect is still preserved. Part of the mechanism involved in the effect of NDGA to rapid degradation of lipid bodies seems to be associated with a rapid activation of proteasome, whereas its classic inhibitor, bortezomib, prevents rapid decrease of both the number of these organelles such as the TXB2 synthesis NDGA induced. Our work is pioneer in demonstrating the rapid effect of lipid body degradation in macrophages by the action of NDGA with the participation of the proteasome. However, further studies are required in order to better understand the impact of the abrupt decrease in lipid body in the physiology of the immune response in the context of inflammatory diseases and neuro-immune-endocrine disorders.

Keyword: macrophage; NDGA;l ipid bodies;p roteasome

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Caracterização da formação de aggresome-like induced structures (alis) em macrófagos murinos estimulados com ligantes de receptores do tipo toll.

Título: Caracterização da formação de aggresome-like induced structures (alis) em macrófagos murinos estimulados com ligantes de receptores do tipo toll.
Aluno(a): Mariana da Silva Siqueira
Orientador(es): Prof(a). Leonardo Holanda Travassos Correa

Aggresome-like induced structures (ALIS) são agregados de proteínas ubiquitinadas formados em células dendríticas e macrófagos, bem como em diversas linhagens celulares, após a estimulação com LPS ou diferentes estímulos estressores. No entanto, ainda é desconhecido se outros agonistas de TLRs são capazes de induzir estas estruturas, bem como o envolvimento de diferentes TLRs e as cascatas de sinalização envolvidas neste processo. Neste trabalho, demonstramos que ALIS também podem ser induzidos em macrófagos murinos mediante a estimulação com Pam3CSK4 (TLR2), R848 (TLR7), DNA CpG (TLR9), Poly (I:C) (TLR3) e imiquimode (TLR7), uma vez que estes induzem a co-localização de p62 e ubiquitina em agregados proteicos nestas células. Por outro lado, a estimulação com flagelina (TLR5) não induz a formação de ALIS. Demonstramos também que a estimulação de macrófagos murinos com agonistas de TLRs indutores de ALIS promove o aumento da expressão de p62 e que a expressão de TLR4 e TLR2 nestas células é essencial para a indução da formação de ALIS por LPS e Pam3CSK4, respectivamente. A inibição da MAPK JNK reduz a formação de ALIS por R848 mas não por Pam3CSK4 e LPS. Demonstramos ainda que espécies reativas de oxigênio possuem um papel parcial na indução de ALIS por R848, mas não são necessárias para a formação destas estruturas mediante a estimulação com LPS ou Pam3CSK4. Finalmente, observamos um maior número de ALIS em MEFs ATG5–/– , deficientes em autofagia, em comparação as MEFs controle, o que sugere a participação da via autofágica para a remoção destas estruturas após sua formação. Nossos resultados sugerem a participação de diferentes TLRs, com exceção do TLR5, no processo de indução de ALIS.

Palavras-chave: ALIS. TLRs. Agregados de proteínas. Macrófagos.

Aggresome-like induced structures (ALIS) are aggregates that contain ubiquitinated proteins and are induced in dendritic cells and macrophages, as well as in various cell lines, upon stimulation with LPS or different cellular stressors. However, it is currently unknown whether other TLR agonists are also able to induce such structures. The role of different TLRs other than TLR4 and the signaling cascades involved also remain to be elucidated. In this study, we show that, in murine macrophages, the formation of ALIS is induced upon stimulation with Pam3CSK4 (TLR2), R848 (TLR7), DNA CpG (TLR9), Poly (I:C) (TLR3) and imiquimode (TLR7), as evidenced by the co-localization of p62 and ubiquitin in protein aggregates in these cells. On the other hand, stimulation with flagelin (TLR5) did not induce ALIS formation. We also show that stimulation of murine macrophages with TLR agonists that induce ALIS formation results in increased p62 expression and that the expression of TLR4 and TLR2 is essential for ALIS formation induced by LPS and Pam3CSK4, respectively. Inhibition of the MAPK JNK results in decreased ALIS formation in response to R848, but not to Pam3CSK4 or LPS. We further demonstrate that reactive oxygen species are partially involved in ALIS formation induced by R848 but are dispensable for the formation of these structures in response to LPS or Pam3CSK4. Finally, we observed an increased number of ALIS in autophagy defective ATG5-/- MEFs, when compared to wild-type controls, suggesting that the autophagic pathway is involved in the clearance of these structures after its formation. Our results reveal the participation of different TLRs, with the exception of TL5, in the process of ALIS formation.

Keyword: ALIS. TLRs. Protein aggregates. Macrophages

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Mecanismos envolvidos na liberação de redes extracelulares de dna (nets) por neutrófilos humanos em resposta ao reconhecimento do fungo Aspergillus fumigatus

Título: Mecanismos envolvidos na liberação de redes extracelulares de dna (nets) por neutrófilos humanos em resposta ao reconhecimento do fungo Aspergillus fumigatus
Aluno(a): Juliana da Costa Silva
Orientador(es): Prof(a). Rodrigo Tinoco Figueiredo

Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na imunidade a infecções fúngicas como observado pela elevada suscetibilidade a estas infecções em indivíduos neutropênicos. Recentemente, foi descrito um novo mecanismo que consiste na liberação de redes DNA para o meio extracelular por neutrófilos, eosinófilos, basófilos e macrófagos. Em neutrófilos, patógenos como bactérias, protozoários e fungos são capazes de induzir a liberação de DNA, porém os mecanismos de sinalização envolvidos em tal resposta ainda são poucos compreendidos. O fungo Aspergillus fumigatus é o principal agente causador das aspergiloses invasivas (AI), condições que apresentam uma alta taxa de mortalidade, acometendo principalmente pacientes submetidos a transplantes de medula óssea e neutropênicos. Deste modo, a investigação das respostas e mecanismos envolvidos na imunopatogênese das infecções causadas por este fungo são fundamentais para a compreensão da patogênese e terapêutica da aspergilose invasiva. Neste trabalho avaliamos os mecanismos de sinalização envolvidos na liberação de redes de DNA (NETs - Neutrophil Extracellular Traps), por neutrófilos humanos em resposta ao fungo A. fumigatus e a β(1,3)-glucana, curdlana. Nossos resultados demonstram que a indução de NETs envolve a participação de β2 integrinas como CD11b/CD18, requer a sinalização mediada por Syk, e a geração de ROS pelo complexo NADPH oxidase. Além disso, observamos que o estímulo com conídios de A. fumigatus, é capaz de promover a citrulinação de histonas H3, porém a liberação do DNA não depende da citrulinação de histonas. Sendo assim, nosso trabalho descreve pontos importantes da via de sinalização envolvida na liberação de NETs frente ao fungo, A. fumigatus

Palavras-chave: Quitina, macrófagos, neutrófilos, TNF

Chitin is the most abundant natural polysaccharide after cellulose, and is an important component of the fungal cell wall, the exoskeleton of insects and the cuticle of helminths. The exposure to chitin is related to allergic processes. Chitin is capable to induce the secretion of cytokines by macrophages, leukocyte recruitment and alternative macrophage activation, besides to contribute for the bronchial hyper-reactivity in models of inflammation induced by the administration of chitin. Although immunomodulatory effects have been attributed to chitin, the mechanisms that promote these effects are not known due to the great controversy regarding chitin purity, particle size, different preparation processes and populations of cells analyzed. Toll-like receptor 2 (TLR2), dectin-1 and the mannose receptor (MR) have been identified as involved in chitin recognition, but the role of these receptors and their responses have been challenged, since they have been attributed to the contamination of the used chitin preparations. This work has the goal to evaluate the macrophage, epithelial cell lines and neutrophil responses to purified chitin. Our results demonstrate that chitin does not induce macrophage TNF production in vitro,, but is capable to bind to these cells. In vivo, chitin induced neutrophilia, TNF production and alveolar macrophages arginase-I activity. Furthermore, a mass spectrometric analysis of RAW cell membrane precipitated with chitin particles identified CD18 as a protein capable to interact with chitin, as well as talin and MARCKS, proteins associated to integrins and phagocytic processes. Chitin particles promoted the reactive species of oxygen (ROS) production by human neutrophils and neutrophils extracellular traps (NET) release. Thus, our results demonstrate that chitin particles are capable to activate neutrophils in vitro and promote pro-inflammatory responses in a model of lung inflammation. In contrast, the in of chitin particles does not promote the release of cytokines by macrophages or epithelial cells or even alternative macrophage activation.

Keyword: Chitin, macrophages, neutrophils, TNF

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Alterações na homeostase de células T reguladores em idosos: influência da involução tímica e da dinâmica populacional periférica.

Título: Alterações na homeostase de células T reguladores em idosos: influência da involução tímica e da dinâmica populacional periférica.
Aluno(a): Pedro Henrique Oliveira Vianna
Orientador(es): Prof(a). Adriana Cesar Bonomo

Um equilíbrio delicado entre células T reguladoras CD4+ Foxp3+ (Treg) e a população de linfócitos TCD4+Foxp3- convencionais (Tconv) no compartimento periférico, mantido estável durante a maior parte do tempo de vida, é essencial para a preservação da auto-tolerância, em paralelo à geração de respostas imunológicas eficientes. Indivíduos idosos apresentam aumento da população de Treg que pode estar associada a imunodeficiência do idoso. O principal objetivo deste trabalho foi analisar o papel da involução tímica e da homeostase periférica sobre a frequência das células T reguladoras periféricas CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) em camundongos idosos. Nossos resultados mostraram que alterações quantitativas da emigração de células T do timo podem alterar a homeostase Treg/Tconv independentemente do estado de envelhecimento do compartimento periférico. Camundongos jovens timectomizados apresentaram aumento progressivo na frequência de células Treg, enquanto o enxerto de um timo funcional jovem em camundongos idosos restaurou a proporção fisiológica de células Treg / Tconv encontrada no animal jovem. Surpreendentemente, as células T derivadas de esplenócitos de doadores jovens ou idosos colonizaram a periferia linfopênica de hospedeiros RAG -/- com a mesma eficiência, levando a números elevados de células Treg em ambos os grupos. Na ausência de emigração tímica, a população de células Treg parece sobreviver por mais tempo, tal como confirmado pela sua baixa percentagem de células Anexina-V+ . Nossos dados sugerem que a população que emigra do timo, contendo uma proporção adequada de linfócitos Treg/Tconv pode ser essencial para manter o equilíbrio entre células Treg e Tconv, que é perdido na ausência do timo, independentemente de alterações no ambiente periférico ou na biologia das células T, associadas ao envelhecimento

Palavras-chave: Envelhecimento, Timo, Células T regulatórias, Homeostase, Linfopenia, Imunosenescência

A tight balance between regulatory CD4+Foxp3+ (Treg) and conventional CD4+Foxp3- (Tconv) T cell subsets in the peripheral compartment, maintained stable throughout most of lifetime, is essential for preserving self-tolerance along with efficient immune responses. An excess of Treg cells, described for aged individuals, may critically contribute to their reported immunodeficiency. In this work, we show that quantitative changes in thymus emigration alter the Treg/Tconv homeostasis regardless of the aging status of the peripheral compartment Thymectomized young mice presented a progressive increase in the Treg cell frequency, while the grafting of a functional young thymus in aged mice restored the young-like physiological Treg/Tconv proportion. Strikingly, T cells derived from young or aged splenocytes colonized the lymphopenic periphery of RAG-/- hosts to the same extent, giving rise to similarly elevated Treg cell levels irrespective of the age of the donor population. In the absence of thymus output, the Treg subset seems to survive longer, as confirmed by their lower proportion of Annexin-V+ cells. Our data suggest that the thymusemigrating population, harboring an adequate proportion of Treg/Tconv lymphocytes, may thus be essential to keep the Treg cell balance, independently of age-related shifts intrinsic to the peripheral environment or to the T cell biology.

Keyword: Ageing, Thymus, Regulatory T cells, Homeostasis, Lymphopenia, Immunosenescence

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2015

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Avaliação da função mitocondrial em células de glioblastoma multiforme com ácido pomólico.

Título: Avaliação da função mitocondrial em células de glioblastoma multiforme com ácido pomólico.
Aluno(a): Tamires da Silva Santos
Orientador(es): Prof. Celio Geraldo Freire de Lima

Glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor cerebral primário mais grave e representa 50% de todos os gliomas. O tratamento consiste na ressecção cirúrgica, seguido de rádio e/ou quimioterapia. Em pacientes com GBM, o resultado dessas abordagens terapêuticas tem sido falha e o tempo médio de sobrevivência permanece menos do que um ano a partir do momento do diagnóstico. Trabalhos realizados pelo nosso grupo mostraram que o triterpeno ácido pomólico (AP) é citotóxico para linhagens de GBM, e que essa atividade é mediada pela via mitocondrial. Porém a atividade desse composto sobre a função mitocondrial ainda não foi investigada. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do AP sobre a função mitocondrial de células de GBM. Foi utilizada a linhagem A172 de GBM humano. O ensaio de MTT mostrou que o AP inibe a viabilidade celular da linhagem. Ensaios utilizando citometria de fluxo mostraram que o AP induziu a fragmentação de DNA, o desacoplamento mitocondrial e a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O efeito do AP na morte celular e produção de ROS foram inibidos pelo tratamento com o NAC. Esses resultados indicam o envolvimento da via mitocondrial e a participação de ROS na indução de morte celular por esse composto. Ensaios com mitocôndrias isoladas utilizando oxígrafo de alta resolução e fluorímetro mostraram que o AP inibe o consumo de oxigênio dos complexos I e IV e aumenta a produção de ROS mitocondrial, respectivamente. O AP também inibiu a produção de ATP determinada por luminescência. Em conjunto, os dados obtidos indicam que o AP altera a função mitocondrial durante a morte celular induzida por este composto e corrobora para sua possível utilização no desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento de GBM.

Palavras-chave: Glioblastoma; Ácido pomólico; mitocôndria

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most severe primary brain tumor and accounts for 50% of all gliomas. Treatment consists of surgical resection, followed by radio and / or chemotherapy. In patients with GBM, the result of these therapeutic approaches has been failure and survival average time remains less than one year from the time of diagnosis. Work carried out by our group showed that the triterpene pomolic acid (PA) is cytotoxic to strains of GBM, and that this activity is mediated by mitochondrial pathway. But the activity of this compound on mitochondrial function has not been investigated. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of AP on mitochondrial function of GBM cells. The A172 strain of human GBM was used. Using the MTT assay it was shown that AP inhibited the cell viability. Assays using flow cytometry showed that AP induced DNA fragmentation, mitochondrial uncoupling and the production of reactive oxygen species (ROS). The effect of PA in cell death and ROS production were inhibited by the treatment with NAC. These results suggest the involvement of the mitochondrial pathway and the involvement of ROS in cell death induction by this compound. Tests on isolated mitochondria using high resolution oxygraph and fluorimeter showed that PA inhibits oxygen consumption in complexes I and IV and increases mitochondrial ROS production, respectively. Luminescence assays showed that AP also inhibits the production of ATP. Together, these data indicate that the PA changes the mitochondrial function during cell death induced by this compound and its possible supports for use in the development of new approaches for treatment of GBM.

Keywords: Glioblastoma; Pomolic acid; mitochondria.

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Caracterização da expressão e dos mecanismos de secreção da IL-1β em eosinófilos humanos.

Título: Caracterização da expressão e dos mecanismos de secreção da IL-1β em eosinófilos humanos.
Aluno(a): Renata Baptista dos Reis
Orientador(es): Profa. Josiane Sabbadini Neves

Eosinófilos contém uma variedade de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento pré-formados em seus grânulos cristaloides citoplasmáticos. Embora muitos trabalhos demonstrem a habilidade dos eosinófilos de pré-estocar e secretar seletivamente citocinas em resposta a estímulos específicos, pouco se sabe à respeito dos mecanismos envolvidos na síntese e secreção de IL-1β. Recentemente foi demonstrado que eosinófilos humanos isolados são capazes de secretar IL-1β, entre outras citocinas, em resposta a diferentes estímulos. Contudo a via de sinalização envolvendo essa secreção não é conhecida. Além disso, não existem evidências diretas na literatura de que eosinófilos humanos pré-estoquem IL-1β, na sua forma precursora ou madura, quer seja nos seus grânulos cristaloides ou em outros compartimentos celulares. Desta forma a proposta do presente trabalho é de investigar a expressão da IL-1β, bem como a via de sinalização que culmina com a secreção desta citocina em eosinófilos humanos. Utilizando citometria de fluxo e microcopia confocal de fluorescência verificamos que eosinófilos humanos são capazes de expressar constitutivamente a citocina IL-1β, assim como proteínas envolvidas na montagem do complexo inflamassoma, NLRP3 e ASC. Demonstramos ainda que eosinófilos humanos secretam a IL-1β para o meio extracelular quando estimulados com GM-CSF (50 ng/mL) de maneira caspase-1 dependente. Ainda segundo nossos achados, a secreção de IL-1β por eosinófilos parece envolver a participação de NLRP3 e ROS. Nossos resultados também demonstraram que a IL-1β secretada por eosinófilos humanos em resposta ao GM-CSF atua de forma autócrina levando à secreção de proteínas catiônicas (possivelmente ECP e EDN). Estes achados podem contribuir de maneira impactante para a identificação de novas vias de sinalização passíveis de modulação para o controle de desordens eosinofílicas.

Palavras-chave: Eosinófilos. Inflamassoma. IL-1β

Eosinophils contain a wide range of preformed cytokines, chemokines and growth factors in their cytoplasmic crystalloid granules. Although many studies have demonstrated the eosinophil ability of pre-storing and selectively secreting cytokines in response to specific stimuli, it is largely unknown how are the mechanisms involved in the synthesis and secretion of IL-1β. Recently it has been shown that isolated human eosinophils are able to secrete IL-1β, among other cytokines in response to different stimuli. However, the signaling pathway involving in this secretion is not known. Furthermore, there is no direct evidence in the literature that human eosinophils can store IL-1β in their mature or precursor form, either in its crystalloid granules or other cellular compartments. Thus, the aim of this study is to investigate the expression of IL-1β and the signaling pathway that culminates in the secretion of this cytokine in human eosinophils. Using flow cytometry and confocal fluorescence microscopy we have found that human eosinophils are capable of constitutively expressing the cytokine IL-1β, as well as proteins involved in assembling the inflammasome complex, NLRP3 and ASC. We also demonstrated that human eosinophils secrete IL-1β into the extracellular medium when stimulated with GM-CSF (50 ng/mL) of caspase-1 dependent manner. Also according to our findings, the secretion of IL- 1β by eosinophils appears to involve the participation of NLRP3 and ROS. Our results also demonstrated that IL-1β is secreted by human eosinophils in response to GM-CSF acts in an autocrine way leading to the secretion of cationic proteins (possibly ECP and EDN). These findings may contribute in a relevant manner to identify new signaling pathways susceptible to modulation to control eosinophilic disorders.

Keywords: Eosinophils. Inflammasome. IL-1β.

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Estudo da imunodeficieênc8ia ligada ao X no curso da infecção experimental pelo Cryptococcus gattii

Título: Estudo da imunodeficieênc8ia ligada ao X no curso da infecção experimental pelo Cryptococcus gattii
Aluno(a): Pablo Rodrigo da Rosa
Orientador(es): Prof. Celio Geraldo Freire de Lima

Um milhão de casos de criptococose meningoencefálica ocorrem por ano. Enquanto Cryptococcus neoformans acomete indivíduos imunocomprometidos, Cryptococcus gattii tem a capacidade de infectar imunocompetentes, sendo as duas principais espécies causadoras dessa infecção fúngica. A cápsula de C. gattii é o seu maior fator de virulência e o principal polissacarídeo capsular é glucuronoxilomanana (GXM). Estudos recentes de anticorpos séricos reativos contra o polissacarídeo capsular GXM relatam uma contribuição importante de anticorpos pré-existentes produzidos naturalmente por células B-1. O modelo de camundongo com imunodeficiência ligada ao X (XID), possui uma mutação no gene que codifica a tirosina quinase de Bruton (Btk), conduzindo a um bloqueio no desenvolvimento de células B, predominantemente células B-1. Estas células residem principalmente nas cavidades peritoneal e pleural secretando IgM e IgG2 em resposta a antígenos independentes do tipo 2 (TI-2), tal como é o componente capsular GXM de C. gattii. Objetivos: Estudar o papel da célula B-1 na infecção experimental por C. gattii. Métodos: Camundongos XID e BALB/c foram infectados por via intratraqueal com C. gattii. A sobrevivência dos animais, variação de peso, carga fúngica, nível de anticorpos anti-GXM, tamanho capsular, citocinas, recrutamento de leucócitos, atividade fagocítica e vacuolização de macrófagos foi avaliada nos dias 0, 7 e 19 do curso infeccioso. Resultados: Nosso modelo de infecção pulmonar crônica revelou que os camundongos com a mutação em Btk, em comparação com animais normais, tiveram mortalidade antecipada, perda de peso significativa, redução no título de IgM e IgG soro-específica para GXM, aumento da carga fúngica cerebral, maior carga fúngica na corrente sanguínea, redução do número de células totais no lavado broncoalveolar, com diminuição de fagócitos e aumento de eosinófilos, concernente ao seu perfil anti-inflamatório de citocinas presentes no BAL. Também houve aumento capsular de C. gattii, fagocitose prejudicada na ausência de opsoninas antígeno-específicas in vitro, baixa taxa de vacuolização dos macrófagos alveolares in vivo e uma incapacidade de conter C. gattii nos pulmões. Conclusão: Nossos resultados mostram que camundongos XID têm maior susceptibilidade à infecção por C. gattii sugerindo que ocorre uma correlação entre a presença de anticorpos anti-GXM e a proteção contra a infecção

Palavras-chave: Célula B-1, Cryptococcus gattii, XID, Btk

One million cases of meningoencephalitis cryptococcosis occur per year. While Cryptococcus neoformans affects immunocompromised individuals, Cryptococcus gattii has the ability to infect immunocompetent, therefore they are considered as the main species that cause this fungal infection. The capsule of C. gattii is the greatest virulence factor and the main capsular polysaccharide of it is the glucuronoxylomannan (GXM). Recent studies reported reactive serum antibodies against the capsular polysaccharide GXM, with an important contribution of preexisting natural antibodies produced by B-1 cells. The X-linked immunodeficiency (XID) mouse model, which has a mutation in the gene that encodes Bruton's tyrosine kinase (BTK), leading to a blocking in B-cell development, predominantly B-1 cells. These cells primarily reside in the peritoneal and pleural cavities, secreting IgM and IgG2 in response to type thymus-independent antigens 2 (TI-2), such as the capsular componente GXM of C. gattii. Objectives: Studing the role of B-1 cell in the experimental infection of Cryptococcus gattii. Methods: XID mice and BALB/c mice were intratracheally infected with C. gattii. The survival of the animals, weight variation, fungal load, level of anti-GXM antibodies, capsule size, cytokines, recruitment of leukocyte, phagocytic activity of macrophages and vacuolization was assessed on the days 0, 7 and 19 of the infectious course. Results: Our model of chronic pulmonary infection revealed that mice with mutations in Btk, compared with normal animals, had early mortality, significant weight loss, low titer of IgM and IgGspecific for GXM, increased brain fungal burden, higher fungal burden in blood stream, reduced in the number of total cells in BAL fluid, with a decrease of phagocytes and an increase of eosinophils, concerning its anti-inflammatory profile of cytokines which present in the BAL fluid. Also there was an increase in capsular C. gattii, an impaired of phagocytosis in the absence of antigen-specific opsonin in vitro, low rate of vacuolation of alveolar macrophages in vivo and the inability to contain C. gattii in lungs. Conclusion: Our results show that XID mice have increased susceptibility to infection by C. gattii suggesting a correlation between the presence of anti-GXM antibodies and protection against infection.

Keywords: B-1 cell, Cryptococcus gattii, XID, Btk

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Função da 5-LIPOXIGENASE na leishmaniose visceral.

Título: Função da 5-LIPOXIGENASE na leishmaniose visceral.
Aluno(a): Luciana Conde Rodrigues Maia
Orientador(es): Prof. Alexandre Morrot Lima

O parasito tripanosomatídeo Leishmania (L.) infantum chagasi é um importante agente causador da leishmaniose visceral e tem como característica a visceralização do parasitismo dado a sua intensa colonização do sistema monofagocítico nuclear. O parasita infecta especificamente macrófagos que, apesar de serem importantes componentes das respostas protetoras devido à intensa fagocitose e a indução de estresse oxidativo capaz de produzir intermediários oxido- e nitro-reativos, consistem no principal reservatório deste patógeno. As respostas efetoras na ativação de macrófagos são críticas no desenvolvimento de proteção à infecção visceral, sendo determinadas pelas respostas inatas e adaptativas do sistema imunológico. Nos modelos propostos para o estudo da infecção pela Leishmania (L.) infantum chagasi, a indução de respostas inflamatórias é essencial para a ativação do do sistema monofagocítico nuclear e a contenção do crescimento parasitário. Neste contexto, diversos estudos ressaltam a função da 5-lipoxigenase, uma enzima chave na via das lipoxigenases, na formação de leucotrienos, importantes mediadores lipídicos inflamatórios críticos na resolução de infecções parasitárias. O presente trabalho visa estudar a participação da enzima 5-lipoxigenase na infecção pelo parasita Leishmania (L.) infantum chagasi. Em nosso estudo utilizamos animais 5-LO-/- e controles selvagens para investigar a importância da via lipoxigenase na indução de respostas protetoras na leishmaniose visceral. Nossos resultados indicam que animais 5-LO-/- são mais suscetíveis ao estabelecimento da doença, apresentando uma resposta imune celular deficiente, com baixo níveis de produção de respostas linfocitárias IFN-y-dependentes, associadas ao controle do parasitismo. Experimentos de reconstituição dos animais deficientes com a população de células T indicam uma função determinante da via 5-lipoxigenase no estabelecimento de respostas adaptativas dependentes de células TCD4+ produtoras de IFN-g. Esses dados apontam para uma função determinante da 5-lipoxigenase na indução de respostas T celulares protetoras contra a infecção pela Leishmania (L.) infantum chagasi

Palavras-chave: Leishmania (L.) infantum chagasi; 5-LIPOXIGENASE; LEISHMANIOSE VISCERAL

The tripanosomatid parasite Leishmania (L.) infantum is an important causative agent of visceral leishmaniasis and is characterized by the visceralization of parasitism given its intense colonization of mononuclear phagocyte system. The parasite infect macrophages specifically, despite beying a major component component of protective response due to intense phagocytosis and induction of oxidative stress capable of production of intermediates oxid- and nitro-reactives, consists on the main reservatory of this pathogen. The effective responses in macrophage activation are critical in the development of protection for visceral infection, determined by the innate and adaptive responses of the immunological system. In the proposed models for the study of infection by Leishmania (L.) infantum chagasi, induction of inflammatory response are essencial for the activation of mononuclear phagocyte system and the containment of parasite growth. In this context, several studieshave emphasized the role of 5-lipoxygenase, a key enzyme in the lipoxygenase pathway, in the formation of leukotrienes, important lipid inflammatory madiators, critical in the resoluction of parasitic infections. This works aim to study the role of the enzyme 5-lipoxygenase in the infection by the parasite Leishmania (L.) infantum chagasi. In our study we used 5-LO-/- animals e wild-type controls to investigate the importance of the lipoxygenase pathway in the induction of protective responses in visceral leishmaniasis. Our results indicate the animals 5-LO- /- are more susceptible to the establishment of the disease, presenting a defective cellular immune response, with low levels of production of lymphocyte responses IFN-y dependent, associated with the parasitism control. Reconstitution experiments of knockout animals with the population of T cells indicate a decisive role of the 5- lipoxygenase pathway in the establishment of adaptive responses of T CD4+ cells IFN-y producers. These data point to a crucial role of 5-lipoxygenase in the induction of T cells protective responses against infection by Leishmania (L.) infantum chagasi.

Keywords: Glioblastoma; Pomolic acid; mitochondria.

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Papel da prostaglandina D2 endógena murina na infecção por Schistosoma mansoni

Título: Papel da prostaglandina D2 endógena murina na infecção por Schistosoma mansoni
Aluno(a): Isaac Belas Cunha dos Santos
Orientador(es): Profa. Christianne Bandeira de Melo

A prostaglandina D2 (PGD2) é um mediador lipídico produzido principalmente por mastócitos na asma alérgica crônica e outras doenças inflamatórias. Recentemente, demonstrou-se que os eosinófilos também são células produtoras de PGD2, que por sua vez é reconhecido como um estímulo potente de ativação de eosinófilos. Durante a infecção por Schistosoma mansoni, PGD2 derivada de Schistosoma aparece como um regulador chave na evasão do parasita da defesa imunológica, controlando a resposta imune cutânea através da inibição da migração das células de Langherhans. No entanto, o papel da PGD2 do hospedeiro durante a infecção por S. mansoni não está estabelecido. Neste trabalho, investigamos o papel de PGD2 produzida pelo hospedeiro durante a progressão da infecção por S. mansoni experimental. Camundongos C57Bl/6 foram infectados por penetração transcutânea com 60-70 cercárias de S. mansoni (cepas BH, Instituto Oswaldo Cruz, RJ, Brasil). No dia 24 de infecção, as bombas osmóticas (Alzet® bomba; 100 µl) contendo HQL-79 (liberando: 24 µg/dia), um inibidor específico da PGD sintase hematopoiética (HPGDS), foram implantadas subcutaneamente em camundongos infectados e não infectados. As bombas permaneceram durante 4 semanas, quando os animais foram sacrificados. Os parâmetros de infecção e eosinofilia, a produção de mediadores lipídicos e a fibrose foram analisados na medula óssea, sangue, lavado peritoneal e no fígado. Constatamos que níveis aumentados de PGD2 são encontrados no fígado e cavidade peritoneal de camundongos infectados por S. mansoni e que essa produção sistêmica de PGD2 foi afetada pelo tratamento com HQL-79. HQL-79 diminuiu o número de eosinófilos no sangue periférico, lavado peritoneal e nos granulomas hepáticos de camundongos infectados com S. mansoni, enquanto vii nenhuma alteração foi observada sobre na quantidade de eosinófilos na medula, indicando que a inibição da síntese de PGD2 afeta apenas a eosinofilia periférica. O tamanho dos granulomas hepáticos não foi modificado por HQL-79, porém a inibição da síntese de PGD2 reduziu o número de granulomas esquistossomóticos no fígado em comparação com camundongos não tratados. Além disso, o tratamento com HQL-79 diminuiu a síntese de leucotrieno C4 hepático, indicando que a PGD2 endógena relacionada à infecção induz a atividade da lipoxigenase durante a infecção. Os resultados indicam que a PGD2 endógena derivada de células hematopoiéticas é um mediador lipídico chave na esquistossomose, controlando a formação de granulomas e instalação da inflamação

Palavras-chave: PGD2, Eosinófilos, Granuloma hepático, Schistosoma mansoni

Prostaglandin D2 (PGD2) is a lipid mediator mainly produced by mast cells in chronic allergic asthma and other inflammatory disorders. Recently, it has been demonstrated that eosinophils are also cell sources of PGD2, which in turn is recognized as a potent stimulus of eosinophil activation. During S. mansoni infection, schistosoma-derived PGD2 has emerged as a key parasite regulator of immune defense evasion, controlling cutaneous immune responses through inhibition of Langherhans cell migration. However, the role of host PGD2 during S. mansoni infection is not established. In this work, we investigated the role of host-derived PGD2 during the progression of experimental S. mansoni infection. C57Bl/6 mice were infected by transcutaneous penetration of 60-70 cercariae of Schistosoma mansoni (BH strain, Institute Oswaldo Cruz, RJ, Brazil). At the 24th day post infection, osmotic pumps (Alzet® pump; 100µl) containing HQL-79 (deliver rate: 24 µg/day), a specific inhibitor of hematopoeitic PGD synthase (H-PGDS), were implanted subcutaneously in infected and non-infected micewhich stayed for 4 weeks, when animals were sacrificed. Infection parameters, eosinophilia, lipid mediator production and fibrosis were analyzed in the bone marrow, blood, peritoneal fluid, and liver. We observed that increased levels of PGD2 are found in the liver and peritoneal cavity of S. mansoni-infected mice and that such systemic production of PGD2 was impaired by HQL-79 treatment. HQL-79 decreased eosinophilia in peripheral blood and eosinophil numbers found in peritoneal fluid and liver granulomas of S. mansoni-infected mice, while no alteration was observed in bone marrow eosinophil numbers, indicating that inhibition of PGD2 synthesis affects only peripheral eosinophilia. Whereas the size of hepatic granulomas was not modified by ix HQL-79, inhibition of PGD2 synthesis reduced the number of schistossomal granulomas in the liver compared to non-treated mice. Moreover, HQL-79 treatment decreased hepatic amounts of leukotriene C4, indicating that infection-related endogenous PGD2 induces lipoxygenase activity during infection. Our results indicate that hematopoeitic cells-derived endogenous PGD2 is a key lipid mediator of schistosomiasis, controlling granuloma formation and installation of systemic increase in eosinophil population during infection

Keywords: PGD2, Eosinophils, Hepatic granuloma, Schistosoma mansoni

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Redes de DNA extracelular de neutrófilos (NETs) Induzidas por laminina e fibronectina isoladamente e em associação com promastigotas de Leishmania amazonensis

Título: Redes de DNA extracelular de neutrófilos (NETs) Induzidas por laminina e fibronectina isoladamente e em associação com promastigotas de Leishmania amazonensis
Aluno(a): Gustavo da Silva Oliveira
Orientador(es): Profa. Elvira Maria Saraiva Chequer Bou Habib

Neutrófilos após vários estímulos tais como Leishmania amazonensis (La), liberam redes extracelulares de neutrófilos (NETS), que são formadas pela cromatina descondensada associada a proteínas citosólicas e granulares. Promastigotas de La são inoculadas pelo inseto vetor numa poça de sangue, onde entram em contato com os neutrófilos e proteínas da matriz extracelular (ECM). Aqui, nós estudamos a interação de neutrófilos com fibronectina e isoformas de laminina, isoladamente ou em associação com La. Analisamos a expressão da integrina α6, um importante receptor de laminina (CD49f), e os nossos resultados mostraram que cerca de 70% dos neutrófilos expressam esse receptor. A seguir avaliamos se neutrófilos estimulados com as diferentes isoformas de laminina (111, 211, 332, 411, 421 e 511) e fibronectina seriam capazes de induzir a liberação de NETs. Os nossos resultados mostram que todas as isoformas de laminina e fibronectina foram capazes de induzir a liberação das NETs de forma dose dependente. No entanto nenhuma das isoformas ou a fibronectina foram capazes de modular a NETose induzida por promastigotas de La. Interessamo-nos também em avaliar possíveis diferenças entre as NETs induzidas por neutrófilos aderidos a uma superfície revestida por laminina ou fibronectina ou em suspensão. Nossos resultados demonstraram que tanto neutrófilos estimulados pelas isoformas de laminina ou por fibronectina, adsorvidas ou em suspensão, foram capazes de liberar NETs. O mecanismo de liberação de NETs é dependente de espécies reativas de oxigênio (ERO), e avaliando este aspecto, detectamos diferenças na ativação dessa via de sinalização entre as isoformas 411 e 511. Nossos resultados sugerem que a produção de ERO esta envolvida na NETose induzida pela isoforma 511, mas não na isoforma 411. A elastase neutrofílica, enzima que participa do processo de descondensação da cromatina, participa da NETose induzida pelas isoformas 411 e 511. Evidenciamos ainda que as cadeias α1, α4 e α5 de laminina colocalizam com as NETs induzidas pelos neutrófilos estimulados com PMA ou La. Juntos, os nossos dados mostram que laminina e fibronectina induzem a liberação de NETs. A NETose induzida pelas isoformas 411 e 511 parece envolver vias de sinalização diferentes. Demonstramos ainda que cadeias α1, α4 e α5 de laminina estão associadas às NETs induzidas por La e PMA.
Palavras-chave: eutrófilos, redes extracelulares de neutrófilos, matriz extracelular, laminina, fibronectina, Leishmania amazonensis.

Neutrophils upon various stimuli such as Leishmania amazonensis (La), release neutrophil extracellular traps (NETs), scaffolds of decondensed chromatin associated with granular and cytosolic proteins. Leishmania promastigotes (La) are inoculated by the insect vector in a pool of blood, in close contact with neutrophils and proteins of the extracellular matrix (ECM). Here, we studied the interaction of neutrophils with fibronectin and laminin isoforms, alone or in combination with La. Firstly, we analyzed the expression of α6 integrin, a major laminin receptor (CD49f), and our results showed that about 70% of neutrophils express this receptor. Next we evaluate if neutrophils stimulated with laminin isoforms (111, 211, 332, 411, 421 and 511) and fibronectin would be capable of inducing the release of NETs. Our results show that all isoforms of laminin and fibronectin were able to induce the release of NETs in a dose dependent manner. However none of the laminin isoforms or fibronectin were able to modulate NETose induced by La promastigotes. We also evaluate possible differences between NETs induction by neutrophils adhered to a surface coated with laminin or fibronectin or in suspension. Our results showed that neutrophils stimulated by the isoforms of laminin or by fibronectin adsorbed or in suspension, were able to release NETs. NET release mechanism is dependent on reactive oxygen species (ROS), and evaluating this aspect, we detect differences in the activation of this signaling pathway between the laminin isoforms 411 and 511. Our results suggest that the production of ROS is involved in NETose induced by the 511 isoform, but not by the 411 isoform. Neutrophil elastase, an enzyme that participates in the chromatin decondensation process, is involved in the NETose induction by both 411 and 511 isoforms. Interestingly, we evidenced that the α1, α4 and α5 laminin chains colocalize with NETs induced by PMA or LA. Together, our data show that laminin and fibronectin induces the release of NETs. NETose induction by the isoforms 411 and 511 seems to involve different ROS signaling pathways. We also demonstrated that α1, α4 and α5 of laminin chains are associated with NETs induced by La and PMA.

Keywords: neutrophil, neutrophil extracellular traps, extracellular matrix, laminin, fibronectin, Leishmania amazonensis.

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2014

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Neutrófilos RANKL+: caracterização e implicações no nicho pré-metastático ósseo

Título: Neutrófilos RANKL+: caracterização e implicações no nicho pré-metastático ósseo
Aluno(a): Triciana Goncalves da Silva
Orientador(es): Profa. Adriana Cesar Bonomo

O câncer de mama é a neoplasia maligna mais frequente entre as mulheres brasileiras, podendo gerar focos metastáticos em órgãos distantes. No caso específico de metástases ósseas, estas representam uma causa importante de morbidade, ocorrendo em 70% das pacientes com metástase. Normalmente, o metabolismo ósseo é bem regulado, entretanto, nas metástases ósseas esse balanço é rompido, ativando a degradação óssea excessiva com liberação de fatores de crescimento que nutrem as células tumorais, que por sua vez, liberam diversos fatores no microambiente ósseo que induzem a diferenciação de osteoclastos, estabelecendo uma alça de alimentação positiva entre a degradação óssea e o crescimento tumoral conhecido como ciclo vicioso da metástase óssea. Nosso grupo adicionou um passo a mais ao ciclo vicioso. No modelo experimental de tumor de mama mostramos que linfócitos Th17 RANKL+ são essenciais na geração do microambiente ideal para o estabelecimento das metástases ósseas, sendo responsáveis pela indução de doença osteolítica pré-metastática, estabelecendo assim o nicho pré-metastático. Surpreendentemente, a perda óssea induzida por células T é precoce e intensa com diminuição de 50% da massa óssea trabecular em apenas 6 dias. Porém, linfócitos T representam 2-5% das células da medula óssea, e não acreditamos que essa população sozinha seja responsável por essa perda óssea tão agressiva. Recentemente, foi descrito que neutrófilos em condições inflamatórias expressam RANKL e são capazes de induzir a formação de osteoclastos funcionais in vitro. No nosso modelo, linfócitos RANKL+ secretam IL17, que é relacionada com neutrófilos e essas células representam 35% das células da medula óssea. Nos perguntamos se esses neutrófilos seriam candidatos que dariam a alça de amplificação para o fenômeno observado. Mostramos que neutrófilos RANKL+ estão presentes nos ossos em condições fisiológicas independentemente de linfócitos T e preferencialmente nos ossos trabeculares. No entento, neutrófilos RANKL+ aumentam em número absoluto e relativo já no 3° dia após o inóculo do tumor, dobrando no 6° dia. Em paralelo, também observamos aumento de neutrófilos RANK+. Através do ensaio de osteoclastogênese in vitro, demonstramos que neutrófilos de medula óssea de animais naives e de animais inoculado com tumor são capazes de induzir a diferenciação de osteoclastos de maneira dependente de RANKL, já que na presença de OPG esse efeito foi abolido. Neutrófilos RANKL+ da medula óssea de animais naives expressam citocinas pró e anti-inflamatórias e nos de animais no 6° dia após o inóculo de células tumorais esse perfil de expressão é alterado, com diminuição da expressão de IL10 e aumento de IL17A e TNFα. Também demonstramos que neutrófilos RANKL+ expressam moléculas relacionadas à interação com linfócitos T e que em animais portadores de tumor essas células aumentam a expressão de CD40. Além disso, em ensaios in vitro e nos experimentos de transferência de linfócitos T para animais NUDEs, observamos que ao contrário dos linfócitos T de animais naives, linfócitos T primados pelo tumor induzem aumento de neutrófilos RANKL+, mais pronunciado na presença de linfócitos T CD8 do que T CD4. Em resumo, nossos resultados sugerem que neutrófilos RANKL+ estão presentes principalmente nas regiões de osso trabecular em condições fisiológicas e durante a progressão tumoral. Antes do aparecimento das metástases ósseas há aumento da expressão de RANKL e RANK em todos os estágios de maturação granulocítica no microambiente ósseo e esses neutrófilos são capazes de induzir a diferenciação de osteoclastos in vitro. Além disso, essas células sofrem influência de fatores presentes na medula óssea de animais com tumor, que modulam o seu fenótipo e linfócitos T educados pelo tumor são capazes de induzir o aumento de neutrófilos RANKL+, sendo os linfócitos T CD8 mais eficientes.

Palavras-chave: Metástase óssea. Osteólise. Neutrófilos.

Breast cancer is the most common malignancy among Brazilian women and may give rise to metastatic foci in distant organs. Bone metastases represent an important cause of morbidity, occurring in 70% of patients with metastatic disease. Normally bone metabolism is tightly regulated, however, in bone metastasis this balance is disrupted, triggering excessive bone degradation, which releases growth factors that will nourish tumor cells. These cells, in turn, will release a variety factors in bone microenvironment that will induce osteoclast differentiation, establishing a positive feedback between bone degradation and growth tumor, known as the vicious cycle of bone metastasis. Our group added one more step to the vicious cycle. In a breast cancer experimental model, we showed that Th17 RANKL+ lymphocytes are essential to induce the ideal microenvironment to establishment bone metastases, being responsible for induction of osteolytic disease in pre-metastatic niche. In our model we observed early bone loss, in 6 days after inoculum of tumor cells we observed a 50% decrease in bone trabecular mass. But, lymphocytes represent a 2-5% of total population in bone marrow, and it´s hard to believe that this small population alone are responsible for this aggressive bone loss. Recently, it has been described that neutrophils in inflammatory conditions express RANKL and RANK and are able to induce functional osteoclasts in vitro. In our model, RANKL+ lymphocytes secrete IL17, that is close related to neutrophils which represent 35% of total bone marrow cells. We asked if RANKL+ neutrophils could be the cells working on a amplification loop for the observed phenomenon. First we investigated if RANKL+ neutrophils were present in bones in physiological conditions. We observed no difference in the distribution of total neutrophils between cortical and trabecular bones, but RANKL+ neutrophils are preferentially in trabecular bones. In accordance to our prediction we observed a significant increase in RANKL+ neutrophils in the bone marrow of animals after 3 days of inoculation of tumor cells, which became even greater on the 6th day. RANK+ neutrophils were also increased in the bone marrow of tumor inoculated animals. Furthermore, in naïve mice RANKL is expressed in all stages of maturation and this profile is maintained in animals inoculated with tumor, but with significant increase in immature cells. As for RANK, it appears in immature neutrophils and increases expression during the maturation process. RANKL+ neutrophils are able to induce osteoclasts differentiation in a RANKL dependent manner, since in the presence of OPG this effect was abolished. RANKL+ neutrophils from naïve animals expresses pro and anti-inflammatory cytokines and in animals on 6th day after tumor inoculum this profile is altered, with decreased expression of IL10 and increased of IL17A and TNFα. We also demonstrated that RANKL+ neutrophils express molecules related to interaction with T cells on the 6th day after tumor inoculum these cells increase CD40 expression. Furthermore, in vitro assays and in T lymphocytes transfer to NUDEs, we observed that, unlike T cells from naive mice, tumor primed T cells induced increase in RANKL+ neutrophils. In vitro, induction of RANKL+ neutrophils was more pronounced in the presence of CD8 than CD4 lymphocytes. Our results suggest that bone marrow RANKL+ neutrophils are mainly distributed in the trabecular region under physiological conditions as well as during tumor progression. These cells induce osteoclastogeneses in vitro and, before tumor metastases to bone, there is an increase in RANKL expression in granulocytes in all stages of maturation. Factors secreted in the bone marrow will modulate granulocytes phenotype and tumor-educated T lymphocytes, especially CD8 lymphocytes, induce an increase in the number of RANKL+ neutrophils.

Keywords: -

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Análise fenotípica linfócitos T gamma/delta na mielopatia associada à infecção pelo vírus linfotrópico para células T humanas do tipo 1 (HTLV-1).

Título: Análise fenotípica linfócitos T gamma/delta na mielopatia associada à infecção pelo vírus linfotrópico para células T humanas do tipo 1 (HTLV-1).
Aluno(a): Raquel Cavalcanti de Albuquerque
Orientador(es): Profa. Juliana Echevarria Neves de Lima

O vírus linfotrópico para células T humano do tipo 1 (HTLV 1) foi o primeiro retrovírus a ser relacionado ao desenvolvimento de doenças em humanos. Ele infecta células T CD4+ e estima-se que cerca de 10 a 20 milhões de pessoas estão infectadas em todo mundo, sendo que cerca de 1 a 5 % desenvolvem alguma das doenças associadas à essa infecção. As principais doenças relacionadas são a leucemia T do adulto e a mielopatia associada ao HTLV 1/paraparesia espástica tropical (MAH/PET), que é uma doença de caráter inflamatório do sistema nervoso central cujo sintoma é a perda progressiva da capacidade motora. As células T γδ são linfócitos T que possuem um TCR γδ que, diferentemente do TCR expresso pelos linfócitos T αβ, não é restrito ao complexo MHC/peptídeo, podendo ser ativado por diferentes antígenos, como lipídeos e fosfoantígenos. Essas células podem apresentar capacidade citotóxica e imunomodulatória e estão associadas a uma resposta imune eficaz a diversos patógenos. Diversos trabalhos também demonstram a participação dessas células em diversas doenças de caráter inflamatório. Assim, no presente estudo analisamos a população de linfócitos T  de sangue periférico obtidos de pacientes portadores do HTLV-1 a fim de compreender o desenvolvimento e a progressão da mielopatia associada ao HTLV-1. Os resultados demonstram que não há nenhuma alteração no percentual das células T γδ em pacientes portadores do HTLV-1 assintomáticos ou sintomáticos, bem como nas subpopulações V1 + ou V2 + . Também não foram observadas alterações no percentual de células CD27+ , molécula associada à memória imunologica e produção de citocinas. Entretanto, observamos importantes alterações no perfil de proteínas associadas à função citotóxica dessas células nos indivíduos infectados com HTLV-1. Identificamos uma redução no percentual de células expressando granzima B mas, surpreendentemente, detectamos aumento na expressão do RNA mensageiro para granzima B, sugerindo que há um aumento da secreção dessa molécula. Além disso, observarmos aumento da expressão dos receptores associados à função citotóxica NKp30 e NKG2D. Também observamos um aumento no percentual de células T γδ produtoras de IFN-γ nos indivíduos infectados. Em conjunto nossos dados demonstram que, apesar de não infectar os linfócitos T γδ in vivo, a infecção com HTLV-1 leva a alterações fenotípicas nessa população, assim, é possível que haja o envolvimento dessas células no controle da infecção ou no desenvolvimento da lesão neurológica nos pacientes portadores da MAH/PET.

Palavras-chave: Fenótipo; Linfócitos T; Mielite; Infecções por HTLV-I; Vírus 1 linfotrópico T humano

The Human T-lymphotropic virus 1 (HTLV 1) was the first retrovirus to be related to human disease. This virus infect T CD4+ cells and it is estimated that about 10-20 million people are infected worldwide, with about 1 to 5 % developing some HTLV-1-related illness. The most important HTLV-1 related diseases are Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), which is a nervous system inflammatory disease of the whose symptom is a progressive loss of motor capacity. The γδ T cells are T lymphocytes that have a γδTCR that, differently from αβ TCR expressed by αβ lymphocytes, is not restricted by MHC/peptide and may be activated by many antigens such as lipids and phosphoantigens. These cells may present cytotoxic and immunomodulatory activity, they are associated with an effective immune response to various pathogens. Many studies showed the participation of these cells in inflammatory disorders. Thereby, in this study, we analyzed the γδ lymphocytes from HTLV-1 patients peripheral blood to understand the development and progression of HAM/TSP. Our results demonstrated there are no alteration in the γδ lymphocytes percentual or γδ subpopulations in asymptomatic or HAM/TSP carriers. There are also no alterations in CD27 expression, molecule associated with immunological memory and cytokine production. However, we observed important alterations in protein associated with the cytotoxic function of these cells in HTLV-1 carriers. We identified a decrease in the granzime B expression but, surprisingly, we detected an increase in the expression of granzime B mRNA, suggesting higher granzime secretion. Moreover, we observed an increase in the expression of cytotoxicity associated receptors NKp30 e NKG2D. We also observed increased rates of IFN-producing in the γδ T in HTLV-1 carriers. Together, ours data demonstrate that HTLV-1 infection leads to phenotypic changes in the γδ lymphocytes population, despite no evidence of in vivo γδ infection, maybe suggesting that these cells are involved in the infection control or in the lesion development in HAM/TSP patients.

Keywords: T lymphocytes, HTLV-1

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Mecanismos moleculares envolvidos na ativação do inflamossomo em resposta ao Aspergillus fumigatus.

Título: Mecanismos moleculares envolvidos na ativação do inflamossomo em resposta ao Aspergillus fumigatus.
Aluno(a): Morena Scopel de Amorim Mendonça
Orientador(es): Prof. Rodrigo Tinoco Figueiredo

Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso oportunista, sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes imunossuprimidos, acometidos com a aspergilose invasiva. O reconhecimento do fungo e a liberação de citocinas como a IL-1β e o TNF-α ocorrem através de receptores da imunidade inata, dentre eles a dectina-1 e o complexo inflamassomo NLRP3. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares envolvidos na ativação do inflamassomo durante a infecção ao A. fumigatus. Macrófagos peritoneais murinos elicitados foram estimulados com conídios de A. fumigatus e liberação de IL-1β e TNF-α foi avaliada por ELISA, enquanto a liberação da IL-1β e de Caspase-1 ativada no sobrenadante das células foi detectada por Western Blotting. A análise da viabilidade mitocondrial foi observada através de microscópio confocal. Observamos que macrófagos liberam IL-1β e TNF-α em resposta ao A. fumigatus, porém, quando dectina-1 e Syk são inibidos, a liberação de IL-1β não ocorre. NLRP3, ASC e caspase-1 são necessários para a liberação de IL-1β por macrófagos murinos estimulados com conídios de A. fumigatus. O efluxo de potássio e a perda de potencial de membrana mitocondrial são necessários para a liberação de IL-1β durante a infecção. Os resultados em conjunto indicam que a liberação de IL-1β em resposta ao A. fumigatus requer a via de sinalização dectina-1/Syk e ativação do inflamassomo NLRP3/ASC/caspase-1 através do efluxo de potássio e da perda do potencial de membrana mitocondrial.

Palavras-chave: Aspergillus fumigatus. Inflamassomo. IL-1β

Aspergillus fumigatus is an opportunistic filamentous fungus, an important cause of morbidity and mortality among immunocompromised patients affected with invasive aspergillosis. The recognition of the fungus and the release of cytokines such as IL-1β and TNF-α occur through the innate immunity receptors, among them the dectin-1 and NLRP3 inflammasome complex. This study aimed to investigate the molecular mechanisms involved in activation of inflammasome during infection to A. fumigatus. Murine peritoneal elicited macrophages cells were stimulated with conidia of A. fumigatus and release of IL1β and TNF- α was assessed by ELISA, while the release of IL- 1β and caspase-1 activated in the cell supernatant was detected by Western blotting. The analysis of mitochondrial viability was observed by confocal microscopy. We observed that macrophages release IL1β and TNF-α in response to A. fumigatus. However when Dectin-1 and Syk are inhibited the release of IL-1β does not occur. NLRP3, ASC and caspase- 1 are required for the release of IL-1β stimulated macrophages with A. fumigatus conidia. The potassium efflux and loss of mitochondrial membrane potential are needed for IL- 1β release during infection. The results indicate that the release of IL- 1β in response to A. fumigatus requires signaling pathway of dectin-1/Syk and inflammasome NLRP3/ASC/caspase-1 activation through the efflux of potassium and loss of mitochondrial membrane potential.

Keywords: Aspergillus fumigatus. Inflammasome. IL-1β

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Mecanismos de morte celular induzidos pelo vírus da dengue em células do endotélio microvascular cerebral humano

Título: Mecanismos de morte celular induzidos pelo vírus da dengue em células do endotélio microvascular cerebral humano
Aluno(a): Michelle Premazzi Papa
Orientador(es): Prof. Luciana Barros de Arruda

A dengue é uma doença viral transmitida pela picada de vetores como Aedes aegypti e Aedes albopictus e é considerada a mais importante arbovirose humana representando um importante problema de saúde pública de preocupação internacional. A infecção por qualquer um dos sorotipos de DENV pode causar tanto a forma clássica da doença como as formas mais graves conhecidas como síndrome de choque da dengue e febre hemorrágica da dengue. As formas mais graves caracterizam-se por hemorragia, trombocitopenia e extravasamento de plasma, que ocorrem devido às alterações de permeabilidade vascular e desregulação de hemostasia. Tanto ativação quanto a lesão de células endoteliais estão associados à perda da integridade do tecido, alteração da permeabilidade vascular e consequente extravasamento de plasma. Um dos mecanismos que podem influenciar na lesão endotelial na dengue é a morte celular. Entretanto os mecanismos de lesão ainda não são claros e, embora a morte celular por apoptose já tenha sido demonstrada em modelos in vitro, outros mecanismos nunca foram investigados assim como sua relação com a infecção viral. Em nosso estudo, utilizamos células do endotélio microvascular cerebral humano (HBMECs) e iniciamos uma análise da morte celular e seus mecanismos induzidos pelo DENV. HBMECs infectadas com DENV2 possuem uma diminuição da viabilidade celular após 72h de infecção, confirmado através do aumento de células marcadas com Anexina V e iodeto de propídio (PI), e da atividade da enzima LDH nos sobrenadantes das culturas. Foi observado que células infectadas apresentam aumento de atividade de caspase 3, sugerindo a indução de apoptose nas culturas. O tratamento dessas células com inibidores específicos de caspases 3, 9 e 8 reverteu parcialmente a liberação de LDH nos sobrenadantes, mas não a marcação com Anexina e PI. Avaliamos, então, a possibilidade de indução de necrose programada através do uso do inibidor de RIP-necrostatina (Nec-1). O tratamento de HBMECs com Nec-1 inibiu a morte celular induzida por DENV, sugerindo que esse mecanismo também pode estar acontecendo nas culturas de células infectadas. Para investigar se as células contendo ou não o antígeno viral sofrem mecanismos diferentes de morte celular, as mesmas foram separadas por ‘cell sorting’. Nós observamos que as células DENV- apresentam a maior proporção de células em processo de morte celular, caracterizado pela dupla marcação com Anexina V/PI e liberação de LDH. Esse fenótipo foi potencializado na presença do inibidor de pan caspases Z-VAD e inibido por tratamento com Nec-1, sugerindo a indução de necroptose em células não infectadas presentes nas culturas contendo DENV.

Palavras-chave: Dengue; Células Endoteliais; Morte Celular; Apoptose; Necrose programada

Dengue is a viral disease transmitted through the bite of mosquitoes Aedes aegypti and Aedes albopictus and is considered the most important human arboviral disease representing an important public health problem of international concern. Infection with any of the DENV serotypes can cause both the dengue classical fever or dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome. The most severe forms are characterized by bleeding, thrombocytopenia and plasma leakage that occurs due to changes in vascular permeability and disruption of hemostasis. Both activation and endothelial cell injury are associated with loss of tissue integrity, alteration of vascular permeability and plasma leakage. One of the mechanisms that may affect endothelial injury is cell death; however, the mechanisms associated to tissue injury were not completely characterized. Apoptotic cell death has been demonstrated in in vitro models of endothelial cell infection, but other death mechanisms and their importance to virus replication have never been investigated before. In our study, we analyzed cell death and its mechanisms induced by DENV, using a human brain microvascular endothelial cell line (HBMECs) as a model. DENV2-infected HBMECs showed a decrease in cell viability after 72h of infection, associated to increased AnnexinV/propide iodide (PI) staining, and by the presence of LDH enzyme in the culture supernatants. DENV-infected cells presented an increased caspase 3 activity, suggesting the induction of apoptosis in the cultures. Treating these cells with inhibitors of caspase 3, caspase 8, and caspase 9 partially inhibited LDH, but not AnnexV/PI staining. We then evaluated whether programmed necrosis would be also triggered by the infection, by inhibiting RIP with necrostatin (Nec-1). Nec -1 treatment inhibited DENV-induced cell death, suggesting that necroptosis may also be stimulated in the cultures. To evaluate whether different mechanisms were induced in DENV-infected (DENV+) and bystander cells (DENV-), we separated each population by cell sorting. We observed that DENV- cells presented a higher proportion of cells with apoptotic/necroptic phenotype, in comparison to DENV+ cells. This was associated to higher LDH release and increased AnnexV/PI staining. This phenotype was potentiated by Z-VAD treatment and inhibited by necrostatin, suggesting that programmed necrosis was induced in the bystander cells presented in the DENV-infected cultures. We intend to investigate these hypotheses in detail and evaluate the effects of cell death on viral replication in our model.

Keywords: Dengue; Endothelial Cells; Cell Death; Apoptosis; Programmed Necrosis

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Análise da resposta imunitária e da susceptibilidade à infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos deficientes em MyD88, IL-1R1 ou IL-18Ra..

Título: Análise da resposta imunitária e da susceptibilidade à infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos deficientes em MyD88, IL-1R1 ou IL-18Ra..
Aluno(a): Joao Francisco Gomes Neto
Orientador(es): Profa. Maria Bellio

Sabidamente, os camundongos Myd88-/- são altamente susceptíveis à infecção por T. cruzi. Além das vias TLR, a molécula MyD88 também está envolvida na sinalização de duas citocinas pro-inflamatórias: IL-1 e IL-1b. Assim, é possível que a deficiência em MyD88 torne os camundongos susceptíveis principalmente devido à ausência das sinalizações mediadas por IL-1R1 e IL-18Ra. No presente trabalho comparamos a susceptibilidade à infecção em camundongos de background B6 deficientes em MyD88 ou nos receptores IL-1R1 ou IL-18Ra, além de vários parâmetros da ativação da resposta imunitária inata e adquirida nestes animais. Avaliamos a parasitemia, sobrevivência, carga parasitária no coração e os níveis de células T CD4+ e CD8+ produtoras de IFN-Γ e GzmB, tanto no baço como no miocárdio. Também quantificamos a produção de IL-10, de TNF-a e de óxido nítrico (NO) por esplenócitos dos camundongos infectados e a expressão de mRNA para CCL5 no miocárdio. Finalmente, investigamos o dano e a função cardíaca nas diferentes linhagens através da atividade da isoenzima CK-MB e do exame de ECG. Os resultados demonstram que animais Il-1r1-/- e Il-18ra-/- apresentam uma susceptibilidade intermediária entre a observada para os camundongos Myd88-/- e os WT, morrendo em tempos precoces pós-infecção e apontam para um maior dano cardíaco dos camundongos MyD88, IL-1R1 e IL-18Ra, em relação aos WT. Sendo assim, o presente trabalho demonstra a importância das vias de sinalização mediadas por IL-1R1 e IL-18Ra na resistência contra a infecção pelo T.cruzi.

Palavras-chave: Trypanossoma cruzi, Linfócitos T, MyD88, IL-1R1, IL-18Ra.;

It is known that Myd88-/- mice are highly susceptible to infection with T. cruzi. In addition to the TLR pathways, the MyD88 molecule is also involved in the signaling cascade induced by two pro-inflammatory cytokines: IL-1b and IL-18. Thus, it is possible that MyD88 deficiency renders mice susceptible mainly due to the absence of signals mediated by IL-1R1 and IL-18Ra. In the present work we compare the susceptibility to infection in mice of the B6-background, either deficient in MyD88 or in the IL-1R1 or IL-18Ra receptors. In addition, different parameters of the innate and acquired immune responses were evaluated in these animals. We analyzed the parasitemia, survival, parasite load in the heart and the levels of CD4+ and CD8+ T cells producing IFN- and GzmB, both in the spleen as in the myocardium. We also quantified the production of IL-10, TNF-a, and nitric oxide (NO) production by splenocytes from infected mice, as well as IL-10, CD8a and CCL5 mRNA expression in the myocardium. Finally, we investigated the cardiac damage and function in the different strains of mice by isoenzyme CK-MB activity in the serum and ECG. The results demonstrate that Il-1r1-/- and Il-18ra-/- mice exhibit an intermediate susceptibility between the one observed in Myd88-/- and WT mice, dying at early time points post-infection. Moreover, Myd88-/-, Il-1r1-/- and Il-18ra-/- mice display more severe heart damage in comparison to WT mice. Therefore, this work demonstrates the importance of the signaling pathways mediated by IL-1R1 and IL-18Ra in resistance against infection with T. cruzi.

Keywords: Trypanosoma cruzi , T lymphocytes, MyD88, IL-1R1, IL-18Ra.

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Infecção de fagócitos derivados de células B-1 (B-1CDP) por Leishmania major.

Título: Infecção de fagócitos derivados de células B-1 (B-1CDP) por Leishmania major.
Aluno(a): Angelica Fernandes Arcanjo Sampaio
Orientador(es): Prof. Celio Geraldo Freire de Lima

As células B-1 são uma pequena fração da população de linfócitos B do baço, e estão presentes como população majoritária de linfócitos B nas cavidades pleural e peritonial. Alguns autores têm demonstrado que as células B-1 secretam IL-10 e são capazes de modular a atividade fagocítica de macrófagos, suprimindo desta maneira o sistema imunitário. Além da capacidade de modulação da atividade fagocítica, outros estudos demonstraram que em camundongos e humanos, as células B-1 podem gerar descendentes fagocíticos, exibindo características similares aos macrófagos. Essas células foram posteriormente denominadas de B-1CDP (fagócitos derivados de célula B-1). Essas evidências nos motivaram a estudar a ação desses fagócitos derivados de células B-1 na infecção experimental por patógenos intracelulares e em processos inflamatórios. Para esse propósito utilizamos o modelo experimental de infecção com Leishimania major. Nossos dados demonstraram que as células B-1CDP são mais susceptíveis a infecção por L. major in vitro e esse efeito pôde ser bloqueado quando adicionamos doses neutralizantes do anticorpo anti-IL-10, o mesmo efeito não foi observado quando adicionamos doses neutralizantes do anticorpo anti-TGF-. Também observamos a presença de um grande número de corpúsculos lipídicos nas células B-1CDP e consequentemente um aumento na produção do mediador lipídico PGE2. As células B-1CDP tem sua produção de IL-10 inibida quando ocorre a inibição da enzima COX-2. Caracterizando assim, que a produção da citocina IL-10 foi significativamente dependente da produção de PGE2. Esses dados fortemente sugerem que as células B-1CDP são componentes celulares que podem comprometer a resposta imune do hospedeiro durante doenças infecciosas.

Palavras-chave: Leishmania major, células B-1, fagócitos, infecção, citocinas e PGE2

B-1 cells are a small fraction of the population of B lymphocytes of the spleen and they represent the major population of B lymphocytes in the pleural and peritoneal cavity. It has been demonstrated that B-1 cells secrete IL-10 and thereby they modulate the phagocytic activity of macrophages, as well as suppress the immune system. This information is based on studies showing that, in mice and human, B-1 cells can generate offspring phagocyte, exhibiting similar characteristics of macrophages. The B-1 cells in primary cultures proliferate and become a mononuclear phagocyte. These cells were called B-1 cell-derived mononuclear phagocyte (B-1CDP). This evidence motivated us to study the actions of B-1CDP cells in infectious and inflammatory processes. For this propose we used the model of experimental infection with Leishmania major. Our data demonstrated that B1CDP are more susceptible to infection by L. major in vitro and this effect is blocked by the pretreatment with neutralizing anti-IL-10 but not anti-TGF-. Also, we observed the presence of a large number of lipid bodies in B-1CDP and PGE2 production. B-1CDP cells are defective in IL-10 production in response to COX-2 inhibitors. The IL-10 production was shown to be significantly dependent on the PGE2 production. These data strongly suggest that B-1CDP cells are cellular components that might compromise host immune responses to infection diseases.

Keywords: Leishmania major, B- 1 cells, Phagocytes, Infection, Cytokines, PGE2;

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Caracterização estrutural e dinâmica do domínio RRM1 do antígeno R humano (HuR), uma proteína central no controle pós-transcricional da resposta inflamatória.

Título: Caracterização estrutural e dinâmica do domínio RRM1 do antígeno R humano (HuR), uma proteína central no controle pós-transcricional da resposta inflamatória.
Aluno(a): Amanda Alves de Almeida Mujo
Orientador(es): Prof. Anderson de Sá Pinheiro

O antígeno R humano (HuR) é uma proteína ubíqua capaz de interferir no destino de tradução de várias proteínas através do reconhecimento de AREs em mRNA. Essa proteína exerce um papel central na resposta inflamatória, pois é capaz de silenciar ou suprimir mRNA’s de importantes componentes do sistema imunológico. A afinidade de ligação da HuR com seus alvos está fundamentada não somente na sua estrutura molecular, mas também na dinâmica em que o estado conformacional de maior afinidade ao ligante é selecionado. A HuR é composta por três domínios funcionais conhecidos como RRM1, RRM2 e RRM3. O domínio RRM1 é o principal responsável pela afinidade de ligação da HuR aos seus alvos de mRNA. No presente estudo, a dinâmica interna do domínio RRM1 isolado (RRM11-99) foi estudada por RMN, com o intuito de estabelecer um paralelo entre estrutura, dinâmica e função para esta proteína. Os espectros de RMN foram coletados em um espectrômetro Bruker 800 MHz utilizando uma amostra purificada do domínio RRM11-99 marcada isotopicamente com 15N e/ou 15N/13C. O assinalamento das ressonâncias do domínio RRM11-99 foi realizado com o programa CARA. A dinâmica da cadeia principal foi derivada das medidas de relaxação do núcleo de 15N, incluindo R1, R2 e {1H}-15N NOE. Os resultados dosestudos de dinâmica revelaram que a função de reconhecimento dos vários alvos daHuR pode estar associada à sua plasticidade estrutural. Dentro deste contexto, otrabalho propõe que a alça L3 do domínio RRM1-99, altamente flexível, pode representar um possível sítio de interação a diferentes moléculas de RNA. Além disso, a presença de resíduos em troca conformacional no sítio primário de ligação ao mRNA (fitas 1 e 3) sugere fortemente que o reconhecimento dos substratos possa ser resultado de XIIuma seleção conformacional, o que infere um certo questionamento à teoria de ajuste induzido proposta anteriormente

Palavras-chave: ZIKV; linfócitos T CD4+; anticorpos; interferon γ; inflamação

Human antigen R (HuR) is a ubiquitous protein that recognizes AREs in mRNA, thereby interfering with the fate of protein translation. This protein plays a central role on the outcome of the inflammatory response as it may stabilize or silence the mRNAs of key components of the immune system. HuR is able to interact with other RBPs, reflecting a complex network that dictates mRNAs post-transcriptional control. HuR is composed of three functional domains, known as RRM1, RRM2 and RRM3. It is known that RRM1 is the most important domain for mRNA binding affinity. In this study, we evaluated the dynamics of HuR’s RRM1 isolated domain by NMR, as to establish a structure, dynamics and function relationship for this protein. The NMR spectra were collected on a 15N- and/or a 15N/13C-labeled purified RRM1 sample using a Bruker 800 MHz spectrometer. Sequence-specific resonance assignment was performed using the program CARA. Backbone dynamics were derived from 15N-relaxation measurements including R1, R2 and { 1H}- 15N NOE. The results from dynamics studies revealed that structural plasticity may be underlying the promiscuous mRNA recognition pattern of HuR. Here, we propose that the RRM1 highly flexible L3 loop may represent a potential site for interaction with different mRNA molecules. Furthermore, the presence of residues undergoing conformational exchange at the mRNA’s primary binding site (1 and 3-sheets) strongly suggests that RNA’s substrate recognition may be related to the phenomenon of conformational selection, which challenges the induced fit theory previously reported

Keywords: ZIKV; linfócitos T CD4+; anticorpos; interferon γ; inflamação

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