Título: Mecanismos envolvidos na indução da netose em resposta ao fungo Aspergillus Fumigatus e o papel das nets na aspergilose experimental
Aluno: Juliana da Costa Silva
Orientador(es): Prof. Rodrigo Tinoco Figueiredo
TESES
Redes de DNA extracelular de neutrófilos (NETs) induzidas por laminina, fibronectina e colágeno isoladamente ou em associação com promastigotas de Leishmania amazonenses
Título
Título: Redes de DNA extracelular de neutrófilos (NETs) induzidas por laminina, fibronectina e colágeno isoladamente ou em associação com promastigotas de Leishmania amazonenses
Aluno: Gustavo da Silva Oliveira
Orientador(es): Prof. Elvira M. Saraiva
Resumo
Diferentes estímulos recrutam neutrófilos (Nθ) da corrente sanguínea, que migram através do endotélio atingindo o tecido, onde desempenham mecanismos microbicidas como fagocitose, degranulação e a liberação das armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Essas etapas ocorrem em íntimo contato com proteínas da membrana basal (BM), matriz extracelular (MEC), onde as lamininas, fibronectina e colágeno são abundantes. Aqui, investigamos as interações entre Nθs e diferentes isoformas de laminina (LM), fibronectina e colágeno analisando a liberação das NETs. Nossos resultados demonstraram que Nθs estimulados com as LM-111, 211, 332, 411, 421 e 511, liberaram NETs. O mesmo aconteceu quando Nθs interagiram com LM 111, 411 e 511 polimerizadas. NETs liberadas por LM foram parcialmente inibidas pelo pré-tratamento dos Nθs com o anticorpo anti-integrina α6, redução de 37%, 32% e 35% quando estimulados com LM-111, -411 e -511, respectivamente. A liberação das NETs por LM-511 ocorreu de forma dependente das espécies reativas de óxigênio (ERO), enquanto a liberação induzida pela LM-411 foi independente de ERO. Além disso, as NETs liberadas pelas LMs foram dependentes da elastase e da peptidilarginina deiminase (PAD)-4, enzimas que participam do processo de descondensação da cromatina. Mostramos que LM-111, 411 e -511apresentam efeito sinérgico sobre as NETs induzidas por promastigotas de Leishmania amazonensis. NETs induzidas por LM-511 apresentam papel leishmanicida. Nos testes com fibronectina plasmática (FNp) e tecidual (FNt) em solução ou adsorvidas à placa na ativação dos Nθs, observamos que apenas a FNt adsorvida foi capaz de induzir NETs, que são reduzidas quando Nθs são pré-tratados com a sequência de aminoácidos arginina-glicina-aspartato (RGD). Colágeno tipo I e IV não induziram a liberação de NETs. Nossos dados revelaram que a LM e FNt podem contribuir para o mecanismo de liberação das NETs pelos Nθs, cujo impacto no curso da inflamação ou infecção necessita de mais estudos.
Palavras-chave: Laminina; redes extracelulares de neutrófilos (NETs); Leishmania amazonensis
Abstract
Different stimuli recruit neutrophils (Nθ) from the bloodstream, which migrate through the endothelium reaching the tissue, where they play microbicidal mechanisms such as phagocytosis, degranulation and the release of extracellular neutrophil traps (NETs). These steps occur in close contact with proteins of the basement membrane (BM), extracellular matrix (MEC), where laminins, fibronectin and collagen are abundant. Here, we investigate the interactions between Nθs and different isoforms of laminin (LM), fibronectin and collagen by analyzing the release of NETs. Our results showed that Nθs stimulated with LM-111, 211, 332, 411, 421 and 511, released NETs. The same happened when Nθs interacted with LM 111, 411 and 511 polymerized. NETs released by LM were partially inhibited by pretreating Nθs with the anti-integrin α6 antibody, a reduction of 37%, 32% and 35% when stimulated with LM-111, -411 and -511, respectively. The release of NETs by LM-511 was dependent on reactive oxygen species (ROS), while the release induced by LM-411 was independent of ROS. In addition, the NETs released by the LMs were dependent on elastase and peptidylarginine deiminase (PAD)- 4, enzymes that participate in the chromatin decondensation process. We show that LM-111, 411 and -511 have a synergistic effect on NETs induced by Leishmania amazonensis promastigotes. NETs induced by LM-511 play a leishmanicidal role. Testing plasma (pFN) and tissue (tFN) fibronectin, in solution or adsorbed to the plate in the activation of Nθs, we demonstrated that only the adsorbed tFN was able to induce NETs, which are reduced when Nθs are pretreated with the amino acid sequence arginine-glycine-aspartate (RGD). Type I and IV collagen did not induce NET release. Our data revealed that LM and FNt can contribute to the mechanism of NETs release by Nθs, whose impact on the course of inflammation or infection needs further stdies. Keywords: laminin; neutrophil extracellular traps (NET); Leishmania amazonensis.
Keywords: Laminin; neutrophil extracellular traps (NET); Leishmania amazonensis
Estudo do papel protetor dos linfócitos T CD4+ e da inflamação cerebral em camundongos infectados com o vírus da Zika
Título
Título: Estudo do papel protetor dos linfócitos T CD4+ e da inflamação cerebral em camundongos infectados com o vírus da Zika
Aluno: Jamil Zola Kitoko
Orientador(es): Profa. Priscilla Christina Olsen, Prof. Marcelo T. Bozza
Resumo
O vírus da Zika (ZIKV) é um vírus da família Flaviviridae, originalmente isolado em 1947 em Uganda, que se divergiu em duas linhagens, a africana e a asiática, estando a última relacionada com a epidemia de doença febril nas Américas em 2015. A infecção por ZIKV em adultos geralmente é assintomática, porém em casos raros ela pode levar à inflamação do sistema nervoso central ou à síndrome de Guillain-Barré. Nestes casos graves, o perfil da inflamação e da infecção cerebral após a infecção por ZIKV é desconhecido. Além disso, a resposta imune adaptativa protetora contra o ZIKV tem sido atribuída aos linfócitos T CD8+ e aos anticorpos neutralizantes, enquanto que o papel dos linfócitos T CD4+ ainda não foi esclarecido. Neste trabalho, estudamos o papel dos linfócitos T CD4+ na infecção por ZIKV, assim como a dinâmica da infecção e inflamação cerebral. Camundongos de 4 semanas de idade deficientes no receptor do interferon do tipo I Ifnar1-/-) foram infectados com as linhagens asiática PE243) ou africana (MR766) de ZIKV (2 × 105 PFU, i.v.) e a resposta imune adaptativa no baço, além da inflamação e infecção cerebral, foram avaliadas. A infecção do camundongo Ifnar1-/- com PE243 levou a ativação de linfócitos T e B protetores, além de baixa inflamação e baixa presença de partículas virais infectivas no cérebro. Por outro lado, a infecção com MR766 foi letal e associada com uma baixa ativação de linfócitos T e com a elevada presença do vírus e de infiltrado de linfócitos T CD8+ e monócitos no cérebro. A transferência adotiva de linfócitos T CD4+ oriundos do animal infectado com PE243 limitou a presença do vírus no cérebro dos camundongos Ifnar1-/- infectados com MR766, protegendo-o da infecção letal de modo dependente de IFNγ. Os linfócitos T CD4+ e o IFNγ se mostraram importantes para a indução da produção de anticorpos IgG neutralizantes anti-ZIKV. Apesar dos macrófagos CD206hi cerebrais serem as principais células infectadas por ZIKV antes da inflamação maciça no cérebro, a depleção dessas células não alterou a presença de leucócitos no cérebro do animal infectado com MR766. Conclui-se que os linfócitos T CD4+ e o IFNγ são cruciais na proteção contra o ZIKV mediada por anticorpos neutralizantes, prevenindo a presença do vírus no cérebro e a letalidade da infecção.
Palavras-chave: ZIKV; linfócitos T CD4+; anticorpos; interferon γ; inflamação
Abstract
The Zika virus (ZIKV) is a member of Flaviviridae family firstly isolated in 1947 in Uganda, which diverged in two strains, the African and Asian, and the last one is related with the epidemic of an exanthematic disease in the Americas in 2015. In adults, ZIKV infection is usually asymptomatic, but in rare cases it leads to the inflammation of the central nervous system or Guillain-Barré syndrome. In these severe cases, the pattern of brain inflammation and infection is not known. In addition, the protective adaptive immune response against ZIKV has been attributed to CD8+ T lymphocytes and neutralizing antibodies, while the role of CD4+ T lymphocytes has not yet been clarified. We aimed to study here the role of CD4+ T lymphocytes as well as the dynamics of brain infection and inflammation during ZIKV infection. Four-week-old mice deficient in type I interferon receptor (Ifnar1-/-) were infected with ZIKV Asian (PE243) or African (MR766) lineages (2 × 105 PFU, i.v.) and evaluated for the adaptive immune response in the spleen and the inflammation and infection of the brain. Infection of the Ifnar1-/- mouse with PE243 led to the activation of protective T CD4+ , T CD8+ and B lymphocytes, in addition to low inflammation and presence of infective viral particles in the brain. On the other side, infection with MR766 as lethal and associated with low activation of T lymphocytes and the high presence of the virus and CD8+ T lymphocytes and monocytes infiltrate in the brain. The adoptive transfer of CD4+ T lymphocytes from PE243-infected mice was able to limit the presence of the virus in the brain of Ifnar1-/- mice infected with MR766, thus protecting from lethal infection. CD4+ T lymphocytes and IFNγ were shown to be critical by inducing ZIKV neutralizing antibodies IgG anti-ZIKV. Although brain CD206hi macrophages are the main cells infected with ZIKV before massive brain inflammation, depletion of these cells did not alter the presence of leukocytes in the brain of the animal infected with MR766. We concluded here that CD4+ T lymphocytes and IFNγ are crucial in the protection against ZIKV mediated by neutralizing antibodies, preventing against viral presence in the brain and lethal infection.
Keywords: ZIKV;CD4+ T lymphocytes;antibodies;interferon γ;inflammation
Mecanismos envolvidos na indução da netose em resposta ao fungo Aspergillus Fumigatus e o papel das nets na aspergilose experimental
Título
Resumo
Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) é um fungo saprofítico ambiental capaz de causar doenças a humanos. Os neutrófilos são células efetoras durante quadros de infecções fúngicas, sendo a neutropenia um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento da aspergilose pulmonar invasiva. Neutrófilos são capazes de liberar NETs (Neutrophil Extracellular Traps) em resposta ao A. fumigatus inibindo assim, a germinação do conídio desse fungo. Neste trabalho foi observado que os receptores TLR2, TLR4 e Dectin-1 não estão envolvidos na liberação de NETs em resposta ao A. fumigatus. No entanto, a participação de CD11b/CD18 é crucial para a liberação de NETs em resposta aos conídios desse fungo, e isso depende do reconhecimento mediado pelo domínio I de CD11b, enquanto o bloqueio do domínio de lectina dessa molécula não afetou a liberação de NETs. A liberação de NETs frente ao A. fumigatus envolve atividade das proteínas Syk, Src cinase(s), PI3K classe IA δ e AKT. No entanto, essa liberação de NETs induzida pelo A. fumigatus não envolve a atividade de PKCs. A liberação de NETs em resposta ao A. fumigatus requer a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela ativação do complexo NOX2, e esta geração de ROS ocorre de forma dependente de CD11b/CD18 (Mac-1), da ativação de Src cinase, Syk e PI3K classe IA δ e AKT. Embora o desafio com A. fumigatus promova citrulinação de histonas, este processo é dispensável para a liberação de NETs em resposta aos conídios desse fungo. Em um modelo experimental de aspergilose pulmonar, camundongos infectados com A. fumigatus apresentam estruturas de redes de DNA em proximidade a conídios, além disso, a administração de DNAseI resulta em aumentada mortalidade no modelo de aspergilose experimental pulmonar. Nossos resultados deste modo demonstram a via de sinalização envolvida na liberação das NETs em resposta ao A. fumigatus e um possível papel dessas NETs em um modelo experimental de aspergilose pulmonar.
Palavras-chave: Aspergillus fumigatus; CD11b/CD18/Mac-1; Neutrophil extracellular traps; Neutrófilos; PAD4
Abstract
Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is an environmental fungus and a human pathogen. Neutrophils are critical effector cells during fungal infections, and neutropenia is a risk factor for the development of pulmonary aspergillosis. NETs are released by neutrophils in response to A. fumigatus and inhibit the conidial germination. In this work we observed that the receptors TLR2, TLR4 and Dectin-1 were dispensable for the A. fumigatus-induced NET release. In contrast, CD11b/CD18 was critical for NET release in response to A. fumigatus conidia, and this required the CD11b I-domain mediated recognition, while the blockade of the CD11b lectin domain did not affect the A. fumigatus induced NET release. A. fumigatus-induced NET release relied on the activity of Syk, Src family kinase(s), and class IA PI3 kinase δ and AKT. In contrast, conventional PKCs were dispensable for the NET release in response to A. fumigatus. The A. fumigatus induced NET release required reactive oxygen species generation by NOX2 complex, in a downstream pathway requiring CD11b/CD18, Src kinase family activity, Syk and PI3K class IA δ and AKT. Although A. fumigatus promoted histone citrullination, this process was dispensable for the NET release in response to A. fumigatus conidia. In experimental model of aspergillosis, mice infected with A. fumigatus showed NETs associated with conidia, furthermore, the administration of DNAseI increased mortality in murine modelo of pulmonary aspergilosis. Our results demonstrate the signaling pathway involved in NETs release induced by A. fumigatus and a possible role of NETs in experimental model of pulmonary aspergillosis.
Keywords: Aspergillus fumigatus; CD11b/CD18/Mac-1; PAD4; Neutrophil extracellular traps; Neutrophil
Dinâmica de subpopulações de linfócitos B na leishmaniose visceral e identificação de epítopo linear conservado como alvo terapêutico de anticorpos protetores
Título
Título: Dinâmica de subpopulações de linfócitos B na leishmaniose visceral e identificação de epítopo linear conservado como alvo terapêutico de anticorpos protetores
Aluno: Luciana Conde Rodrigues Maia
Orientador(es): Prof. Alexandre Morrot Lima, Prof. Célio Geraldo Freire de Lima
Resumo
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada causada por protozoários do gênero Leishmania transmitido por vetores flebotomíneos. Classicamente, a LV causa hepatoesplenomegalia, sendo o fígado e o baço os principais órgãos acometidos durante a doença. A LV é associada com imunossupressão sistêmica, levando a inabilidade do hospedeiro vertebrado de combater a disseminação do parasita. Na literatura, é demonstrado que a resposta imune humoral atua favorecendo o parasitismo e exacerbação da doença. As células B possuem diferentes subpopulações que diferem em seu aspecto fenotípico e funcional. Neste trabalho, avaliamos a dinâmica das subpopulações de células B no curso da LV experimental por L. infantum chagasi, a fim de expandir o conhecimento da resposta humoral às leishmanioses. Demonstramos que há diminuição de células de zona marginal (MZ) no baço de animais infectados durante o curso da infecção, essas células perdem seu potencial responsivo em períodos tardios secretando menos anticorpos frente a estímulos policlonais. No timo, demonstramos que há um aumento de células B no curso da infecção, evidenciado pelo aumento de células B CD23+ e diminuição tardia de células B CD5+ . Em conjunto, esses dados demonstram mudanças pontuais no compartimento de células B no curso da LV experimental. Em adição a esses estudos, também investigamos a presença de epítopos lineares de célula B a partir de análise de microarray de peptídeos cobrindo todas as sequências possíveis de proteínas de superfície de formas infectivas do parasita. Detectamos um epítopo imunodominante no soro de camundongos C57BL/6 infectados, o qual representa a sequência linear conservada evolutivamente ANTSNMP presente em um sítio catalítico da ATPase Vacuolar (V-ATPase). Nosso ensaios in vitro demonstraram que anticorpos monoclonais inibem a atividade da enzima causando diminuição na porcentagem de macrófagos infectados e menos replicação intracelular do parasita. Análise da imunidade humoral de camundongos infectados demonstrou aumento de anticorpos IgM e diminuição de IgG anti-ANTSNMP, sugerindo uma possível restrição a mudança de classe para formas efetoras de anticorpos contra este epítopo. Este trabalho demonstra evidências que levam ao questionamento sobre o mimetismo molecular entre epítopos lineares de célula B compartilhados entre o parasita e o hospedeiro vertebrado induzindo tolerância imunológica ao parasita, restringindo a diferenciação de respostas humorais efetoras e contribuindo para a persistência do parasita associada a imunossupressão característica da LV.
Palavras-chave: Células B; leishmaniose visceral; epítopos lineares.
Abstract
Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected disease caused by protozoa of the genus Leishmania transmitted by sandfly vectors. Classically, VL causes hepatosplenomegaly, with the liver and spleen being the main organs affected during the disease. VL is associated with systemic immunosuppression, leading to the vertebrate host’s inability to contain parasite spread. It has beendemonstrated that the humoral immune response acts favoring parasitism and disease exacerbation. B cells have different subpopulations that differ in their phenotypic and functional aspect. In this work, we evaluate the dynamics of B cell subpopulations in the course of experimental VL by L. infantum chagasi in order to expand the knowledge of the humoral response to leishmaniasis. We demonstrate a decrease in marginal zone (MZ) cells in the spleen of infected animals during the course of infection, these cells lose their responsive potential in later periods by secreting fewer antibodies against polyclonal stimuli. In thymus, we demonstrated that there is an increase of B cells in the course of infection, evidenced by the increase of CD23+ B cells and late decrease of CD5+ B cells. Taken together, these data demonstrate point changes in the B cell compartment in the course of experimental VL. In addition to these studies, we also investigated the presence of linear B-cell epitopes from peptide microarray analysis covering all possible surface protein sequences of infectious forms of the parasite. We detected an immunodominant epitope in the serum of infected C57BL/6 micethat represents the evolutionarily conserved linear sequence ANTSNMP present at a Vacuolar ATPase (V-ATPase) catalytic site. Our in vitrodemonstrated that monoclonal antibodies inhibit enzyme activity causing a decrease in the percentage of infected macrophages and less intracellular replication of the parasite. Analysis of humoral immunity of infected mice demonstrated increased IgM antibodies and decreased anti-ANTSNMP IgG, suggesting a possible restriction of class switching to effector forms of antibodies against this epitope. This work demonstrates evidence leading to the question of molecular mimicry between linear B-cell epitopes shared between parasite and vertebrate host inducing parasite immunological tolerance, restricting the differentiation of effector humoral responses and contributing to parasite persistence associated with characteristic immunosuppression. from LV.
Keywords: B cells; visceral leishmaniasis; linear epitopes
Siga nosso perfil no Instagram
Links Úteis
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde – Bloco D (sala D1-029) Cidade Universitária – Ilha do Fundão
CEP 21.941-590 – Rio de Janeiro – RJ – Telefone: (21) 3938-6748 – E-mail: pos_imuno@micro.ufrj.br
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde – Bloco D (sala D1-029) Cidade Universitária – Ilha do Fundão
CEP 21.941-590 – Rio de Janeiro – RJ
Telefone: (21) 3938-6748
E-mail: pos_imuno@micro.ufrj.br
