TESES
Avaliação da resposta imune anti-HIV: desenvolvimento de vacina e estudo da ativação imune crônica
Título
Título: Avaliação da resposta imune anti-HIV: desenvolvimento de vacina e estudo da ativação imune crônica.
Aluno(a): Carolina Goncalves de Oliveira Lucas
Orientador(es): Profa Luciana Barros de Arruda
Resumo
A infecção por HIV está associada à depleção de linfócitos TCD4+ e disfunção de diferentes compartimentos do sistema imune. O desenvolvimento de imunoterapias, visando à recuperação imune dos pacientes HIV+ é uma das estratégias propostas para indução de resposta imune vírus-específica e controle da infecção. Por outro lado, a ativação imune generalizada está correlacionada com a progressão para a AIDS. Proliferação de células T e um aumento de expressão dos marcadores de ativação são observados em células T vírus-específicas, mas também em células não específicas, sugerindo ativação bystander dessas células durante a infecção crônica pelo HIV. Nesta tese abordaremos esses dois aspectos da infecção por HIV: (i) o desenvolvimento de novas estratégias de imunoterapia; e (ii) o papel de um dos mediadores inflamatórios, cuja expressão é aumentada em pacientes crônicos, na ativação inespecífica de linfócitos T e células NK. Na primeira parte da tese avaliamos uma vacina (mLg-DC) baseada na utilização de células dendríticas (DC) primárias transfectadas com a quimera de DNA plasmidial LAMP/gag, previamente analisada por nosso grupo. Diferentes estratégias baseadas no uso de DCs como veículo vacinal têm sido avaliadas no contexto da infecção por HIV; no entanto uma comparação entre as mesmas não é realizado de forma sistemática e um protocolo ótimo de vacinação ainda não é conhecido. Nossos dados demonstraram que a imunização de camundongos com a vacina mLg-DC gera potente e prolongada resposta imune, sistêmica e de mucosa, mediada por células TCD4+, TCD8+ e células B. Esta abordagem parece ser mais efetiva do que outras estratégias que vem sendo utilizadas, incluindo o uso de DCs transfectadas com gag nativa ou pulsadas com HIV inativado. Além disso, DCs humanas transfectadas com LAMP/gag induziram potente resposta imune Gag-específica, mediada por linfócitos T obtidos de pacientes HIV+, demonstrando o potencial de Lg-DCs como uma nova estratégia de vacinação contra o HIV. Na segunda parte da tese, investigamos o papel da IL-15 na ativação inespecífica de linfócitos T e células NK, obtidas de doadores saudáveis e pacientes HIV+. Níveis elevados de IL-15 são observados em pacientes HIV+, e esta citocina é produzida por DCs ativadas por ligantes de TLR, como LPS, cujos níveis circulantes estão também aumentados nesses pacientes. Estudos anteriores sugeriram que a IL-15 ativa linfócitos TCD8+, de maneira antígeno-independente, sugerindo que a citocina pode estar envolvida na ativação imune crônica, bystander, na infecção por HIV. Neste estudo foi demonstrado que a IL-15 estimula células NK e ativa células TCD4+ e TCD8+ de forma antígeno-independente. Foi observado um aumento da expressão de marcadores de ativação, aumento de proliferação e de atividade citotóxica por todos os tipos celulares avaliados, obtidos de doadores HIV- e HIV+. Além disso, demonstramos que DC ativadas por LPS estimulam linfócitos TCD4+, TCD8+ e células NK, de maneira dependente de IL-15 e independente de antígeno, sugerindo que esse pode ser um dos mecanismos envolvidos na ativação bystander de células T, e pode contribuir para a ativação imune crônica observada durante a infecção pelo HIV.
Palavras-chave: HIV;Células NK;TCD4
Abstract
HIV infection is associated with CD4+ T cells depletion and impairment of different compartments of the immune system. The development of immunotherapies, aiming the immune recovery of HIV+ patients is one of the proposed strategies for induction of virus-specific immune response and infection control. On the other hand, general immune activation correlates with AIDS progression. Proliferation of T cells and increase expression of activation markers are observed in virus-specific T cells but also in non-specific cells, suggesting bystander activation during chronic HIV infection. At this thesis we discuss these two aspects of HIV infection: (i) the development of new immunotherapy strategies; and (ii) the role of the inflammatory mediators whose expression is increased in chronic patients in non-specific activation of T lymphocytes and NK cells. At the first part of this thesis we evaluated a vaccine (mLg-DC) based on the use of primary dendritic cells (DC) transfected with the plasmid DNA chimera LAMP/ gag, previously analyzed by our group. Different strategies based on the use of DCs as a vaccine vehicle have been evaluated in the context of HIV infection; however a comparison between them is not carried out systematically and the vaccination protocol is not known yet. Our data demonstrate that mice immunization with the mLg-DC vaccine generates potent and prolonged immune response, systemic and at mucosal, mediated by CD4+/CD8+ T and B cells. This approach seems to be more effective than others strategies that have been used, including the use of DCs transfected with native gag or pulsed with inactivated HIV. In addition, human DCs transfected with LAMP/gag induced potent immune response, Gag-specific, mediated by T lymphocytes obtained from HIV+ patients, demonstrating the potential of Lg-DC as a new vaccination strategy against HIV. At the second part of this thesis, we investigated the role of IL-15 in non-specific activation of T lymphocytes and NK cells obtained from healthy donors and HIV+ patients. Elevated levels of IL-15 are observed in HIV+ patients, and this cytokine is produced by activated DCs by TLR ligands such as LPS, whose circulating levels are also increased in these patients. Previous studies have suggested that IL-15 activates CD8 T cells in an antigen-independent manner, suggesting that this cytokine may be involved in chronic immune activation, bystander, in HIV infection. This study demonstrated that IL-15 stimulates NK cells and activates CD4 and CD8 T cells in an antigen-independent manner. An increased expression of activation markers was observed, increased proliferation and cytotoxicity activity by all cell types assessed, obtained from HIV- and HIV+ donors. Furthermore, we demonstrate that DC activated by LPS stimulate CD4, CD8 T cells and NK cells dependent of IL-15 but in an antigen-independent manner, suggesting that this may be one of the mechanisms involved in bystander T-cell activation, and may contribute to chronic immune activation observed during HIV infection.
Palavras-chave: HIV; NK CELLS; TCD4
Avaliação da expressão e do papel da proteína príon celular na infecção pelo HTLV-1.
Título
Título: Avaliação da expressão e do papel da proteína príon celular na infecção pelo HTLV-1.
Aluno(a): Isabela Silva de Castro
Orientador(es): Profa Juliana Echevarria Neves de Lima
Resumo
A infecção causada pelo vírus linfotrópico de células T humano do tipo 1 (HTLV-1), vírus endêmico no Brasil, pode induzir diversas manifestações clínicas de caráter inflamatório, inclusive a mielopatia associada a infecção pelo HTLV-1/paraparesia espástica tropical (MAH/PET). A MAH/PET é uma manifestação clínica grave considerada uma doença neuroinflamatória crônica que, em longo prazo, pode levar a perda da capacidade motora. Ainda assim, permanecem desconhecidos os mecanismos pelos quais a doença tem início ou o que induz o portador do vírus a progredir de um estado assintomático para o estado de neuroinflamação. Por outro lado, estudos têm demonstrado que a proteína príon celular (PrPc) é expressa em células do sistema imune e pode ser regulada durante processos inflamatórios e infecciosos, incluindo infecções virais. Sendo assim, foi avaliada a expressão de PrPc e seu possível papel em linfócitos de indivíduos infectados, bem como em linhagens células linfoides T, permanentemente infectadas pelo HTLV-1. Foi observado que tanto as células T CD4+ e CD8+ dos indivíduos infectados, quanto as linhagens celulares infectadas, expressam redução na porcentagem de células PrPc positivas, bem como, reduzida expressão da proteína na superfície celular. Ao investigarmos a natureza da regulação negativa de PrPc, foram detectados níveis de RNA diminuídos para a proteína apenas em células CD4+ de indivíduos assintomáticos. Como a PrPc pode sofrer clivagem por ADAMs (metaloproteinases com domínio desintegrina), mesmo em condições fisiológicas, foi avaliado na presença de MnCl2, pois o metal é capaz de aumentar a atividade catalítica de algumas metaloproteinases. Observamos em células C91 (linhagem permanentemente infectada) que o MnCl2 acentuou a diminuição da expressão de PrPc. Além disso, detectamos a presença de quantidades significativamente maiores de fragmentos de PrPc no soro de indivíduos infectados. A infecção está diretamente relacionada com a diminuição de PrPc. Sugerimos que esse seja um efeito da atividade da proteína viral p12, visto que células transfectadas com o plasmídeo mutante capaz de gerar altos níveis de p12 promove a redução da PrPc, e na ausência de p12 o fenômeno não foi observado. No entanto, os linfócitos T CD8+, que não são o principal alvo para a infecção, também apresentam uma redução na expressão de PrPc. As células T CD8+ PrPc negativas de indivíduos infectados apresentam aumento na expressão de CD25+e produção de IFN e granzima B, sugerindo que estas células apresentam um perfil de células ativadas. Desta forma, pode-se sugerir que a PrPc possa exercer um papel na infecção pelo HTLV-1, pois podem estar associadas ao controle da infecção ou ao desenvolvimento de doenças associadas à infecção.
Palavras-chave: htlv;PRÍON
Abstract
The infection caused by the human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1), an endemic virus in Brazil, can induce many different clinical manifestations of inflammatory nature, including myelopathy associated to HTLV-1 / tropical spastic paraparesis (HAM/ TSP). The HAM/TSP is a severe clinical manifestation considered to be a chronic neuroinflammatory disease that, in long term, can lead to loss of motor ability. Nonetheless, the mechanisms by which the disease begins or what causes the carrier of the virus to progress from asymptomatic to neuroinflammation status remain unknown. More recently studies have shown that cellular prion protein (PrPc) is expressed in the immune system cells and can be regulated during inflammatory and infectious diseases, including viral infections. Thus, the expression of PrPc and its possible during HTLV-1 infection was assessed in lymphocytes from infected patients as well as T lymphoid cell lines permanently infected with HTLV-1. It was observed that CD4 + and CD8 + T cells from infected subjects, as well as the infected cell lines, expressed reduced percentage of PrPc-positive cells and reduced expression of the protein in the cell surface. When investigating the nature of PrPc downregulation, we showed that the PrPc RNA levels are decreased only in CD4 + cells from asymptomatic individuals. As PrPc can be cleaved by ADAMs (metalloproteinase with disintegrin domain) even under physiological conditions, it was evaluated if the presence of MnCl2, would interfere in PrPc expression since the metal is capable of increasing the catalytic activity of some metalloproteinases. We observed that in C91 cells (permanently infected strain) MnCl2 further reduced PrPc expression. Moreover, we detected the presence of significantly higher quantities of PrPc fragments in serum of infected subjects. The infection is directly related to PrPC reduction. We suggest this is an effect of the viral protein p12 activity, since cells transfected with a mutant plasmid capable of generating high levels of p12 promotes the reduction of PrPc and in the absence of p12 the phenomenon was not observed. Although CD8+ T cells are not the primary target for infection, they also showed a reduction in PrPc expression. CD8+ T PrPc Negative cells from infected individuals exhibited increased expression of CD25+ and production of granzyme B and IFNγ, suggesting that these cells have an activated cell profile. Thus, we can suggest that PrPc may play a role in HTLV-1 infection, as they it may be associated with the control of the infection or with the development of diseases associated with HTLV-1 infection.
Palavras-chave: htlv;PRÍON
Dinâmica de renovação das células t reguladoras CD4+ Foxp3+ no compartimento periférico.
Título
Título: Dinâmica de renovação das células t reguladoras CD4+ Foxp3+ no compartimento periférico.
Aluno(a): Jeane de Souza Nogueira
Orientador(es): Profa Maria Bellio
Resumo
As células T reguladoras CD4+ Foxp3+ (Treg) constituem uma importante subpopulação de linfócitos T CD4+ envolvida no estabelecimento da auto-tolerância e na regulação de diversas respostas imunológicas a antígenos não-próprios e na homeostase periférica dos linfócitos T. Esta subpopulação é composta por células Foxp3+ naturais de origem intratímica (nTreg) e por células Treg perifericamente induzidas diferenciadas de células T convencionais Foxp3-(iTreg). A sua frequência nos órgãos linfoides periféricos é mantida estável nos indivíduos jovens, sugerindo que uma competição por persistência periférica deve existir entre as células Treg residentes, sejam elas naturais ou induzidas, e as células Treg que emigram continuamente do timo. As regras que determinam a sobrevivência e a substituição das células Treg na periferia ainda não foram totalmente elucidadas. Neste trabalho, analisamos a dinâmica de renovação periférica das células Treg comparada à das células T convencionais CD4+ Foxp3- (Tconv). Inicialmente confirmamos os resultados obtidos previamente em minha dissertação de mestrado, utilizando protocolos de transferências sucessivas de timócitos ou esplenócitos de doadores congênicos para hospedeiros linforrepletos ou linfopênicos, onde uma incorporação preferencial de células Treg, comparada as células Tconv, foi observada. Verificamos que esta maior renovação na população de células Treg correlacionouse com taxas aumentadas de proliferação das células Treg que chegam na periferia e maior taxa de morte das células Treg residentes quando o ambiente é linforrepleto. A dinâmica de renovação de ambas as subpopulações (Treg e Tconv) foi resistente às alterações ambientais temporárias induzidas por inflamação ou mudanças na microbiota. Surpreendentemente, em hospedeiros RAG2-/- , esta substituição XI preferencial de células Treg não foi observada, sugerindo uma dependência dos linfócitos B. A transferência semanal de células B para estes hospedeiros recuperou a incorporação preferencial de células Treg, indicando um novo aspecto dos linfócitos B em regular a homeostase periférica dos linfócitos T recém chegados. O melhor conhecimento da dinâmica de renovação periférica das células Treg poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas adequadas, envolvendo a utilização de células Treg, para restaurar a auto tolerância em doenças autoimunes ou regular respostas imunológicas contra antígenos não-próprios.
Palavras-chave: células T reguladoras; células T convencionais; compartimento periférico; dinâmica de renovação;nicho;competição; homeostase
Abstract
CD4+ Foxp3+ regulatory T cells (Treg) belong to an important subset of CD4 lymphocytes involved in the establishment of self-tolerance and in the regulation of many immune responses to nonself antigens and of peripheral T cell homeostasis. This subset is composed by natural intra thymic Foxp3+ cells (nTreg) and by peripherally induced Treg cells differentiated from the conventional Foxp3- T cells (iTreg). Their frequency of Treg cells is kept stable in young individuals, suggesting that a competition for peripheral persistence may exist between natural or induced residents Treg cells, and those continuously emigrating from the thymus. The rules determining the survival and replacement of Treg cells in the periphery are not totally elucidated. In this study, we analyzed the dynamics of peripheral renewal of Treg cells compared to that of conventional CD4+ Foxp3- T cells (Tconv). We first confirmed the results previously obtained during my master thesis, using protocols of thymocytes or splenocytes successive transfers derived from congenic donors to normal or lymphopenic hosts, where a preferential incorporation of Treg cells, compared to Tconv cells, was seen. We then verified that the enhanced renewal in the Treg population was associated with their increased rates of proliferation, and with a higher rate of death when these Treg cells ingress into a fully colonized environment. The renewal dynamics of both subsets (Treg and Tconv) was resistant to temporary environmental changes induced by inflammation or microbiota shifts. Surprisingly, in the RAG2-/- hosts the favored substitution of Treg cells was not observed, suggesting its dependence on B lymphocytes. The weekly transfer of B lymphocytes to these hosts recovered the preferential incorporation of Treg cells, indicating a new aspect of B cells in the regulation of peripheral homeostasis of XIII recently arrived T lymphocytes. This study may help to develop appropriate therapeutic strategies, involving Treg cells manipulation, in order to restore selftolerance in autoimmune diseases or to regulate immune responses to nonself antigens.
Palavras-chave: regulatory T cells; conventional T cells; niches; homeostasis; peripheral compartment; renewal dynamics; competition
ATRvD1 atenua a lesão renal aguda pós-sepse em camundongos
Título
Título: ATRvD1 atenua a lesão renal aguda pós-sepse em camundongos
Aluno(a): Jose Bruno Nunes Ferreira Silva
Orientador(es): Profa Claudia Farias Benjamim
Resumo
Sepse é uma síndrome inflamatória, metabólica e sistêmica onde observa-se uma resposta desregulada do hospedeiro ao estímulo infeccioso. Envolve respostas pró- e anti-inflamatórias associadas a um conjunto de alterações fisiológicas e bioquímicas que resultam em complicações da homeostase de diferentes órgãos. Pacientes que sobrevivem à sepse apresentam maior susceptibilidade a infecções secundárias com menor taxa de recuperação e maior mortalidade. Os rins são órgãos afetados durante a sepse e a insuficiência renal aguda é um comprometimento tardio que pode evoluir para insuficiência renal crônica cujo tratamento lança mão de terapias duradouras e recorrentes. Neste estudo avaliamos os efeitos do tratamento com um epímero da resolvina D1 (ATRvD1) na lesão renal de animais pós-sépticos submetidos ao estímulo secundário com alta concentração de albumina. O tratamento com ATRvD1 se deu do décimo quinto até o vigésimo primeiro dia após a indução da sepse pelo modelo de lesão e perfuração do ceco (CLP). Os animais foram tratados via intravenosa por sete dias imediatamente antes da administração intraperitoneal da albumina. No vigésimo segundo dia, os rins foram coletados para análises. Observamos que o tratamento com ATRvD1 preveniu o agravamento da lesão túbulointersticial e fibrose renal dos animais pós-sépticos que receberam o insulto secundário com albumina. A proteinúria, a apoptose e o aumento da celularidade nos glomérulos foram atenuados após o tratamento. Em adição, verificamos o efeito inibitório do ATRvD1 sobre a expressão de TGF-, colágeno do tipo III, MMP-3 e MMP-9. O tratamento atenuou a expressão de S100A4, vimentina e iNOS no tecido renal, como também, atenuou a produção das citocinas TNF- e IL1-. Em adição, a expressão gênica de TNF-, IL-10 e IFN- foi reduzida com o tratamento. Nossos resultados mostraram que ATRvD1 melhorou a função renal e inibiu a produção de mediadores envolvidos na fibrose e inflamação responsáveis pelo agravamento da lesão renal aguda em animais pós-sépticos submetidos ao insulto secundário com albumina.
Palavras-chave: Sepse; IRA; Albumina; ATRvD1; Fibrose; Inflamação
Abstract
Sepsis is a metabolic and systemic inflammatory response to infection that exhibits pro- and anti- inflammatory responses associated to biochemical and physiological changes, which is associated to failure of different organs. Sepsis survival patients are often more susceptible to secondary infections with delay in the recovery and increase in the mortality. Acute kidney injury (AKI) is a common sequel of sepsis that can progress to chronic kidney disease, which requires replacement therapy. In this study we evaluated the effects of the resolvin D1 epimer (ATRvD1) on acute kidney injury of post-sepsis mice susceptible to secondary albumin kidney hit. Fifteen days after cecal ligation and puncture (CLP) procedure, surviving mice were treated intravenously with ATRvD1 and submitted to a high concentrated bovine serum albumin intraperitoneal injection, which induces AKI. ATRvD1 treatment was performed for seven days right before the bovine serum albumin injections. On day twenty-two, the kidneys were collected for analysis, while for renal function the 24 h urine was collected at day 21. We found that ATRvD1 administration attenuated renal tubule-interstitial injury and fibrosis in sepsis-surviving mice. The urinary protein and glomerular cells apoptosis and number were also reduced in ARTvD1 treated mice. In addition, ATRvD1 inhibited the expression of TGF-, collagen type III, MMP-3 and MMP-9. The treatment reduced the renal tissue overexpression of the S100A4, vimentin, and iNOS. In addition, ATRvD1 reduced pro-inflammatory cytokines TNF- and IL-1 levels and downregulated TNF-, IL-10 and IFN- gene expression. Our results showed that ATRvD1 improves renal function by inhibiting the production of fibrotic and inflammatory mediators involved in the progressive AKI in post-sepsis mice subjected to second kidney albumin hit.
Palavras-chave: Sepsis; AKI;Albumin; ATRvD1; fibrosis; inflammation
Estudo das vias de sinalização envolvidas na netose induzidas por L. amazonensis e proteína Amiloide.
Título
Título: Estudo das vias de sinalização envolvidas na netose induzidas por L. amazonensis e proteína Amiloide.
Aluno(a): Natalia Cadaxo Rochael
Orientador(es): Profa Elvira Maria Saraiva Chequer Bou Habib
Resumo
As redes extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas em forma de rede e compostas por DNA, histonas e proteínas de diferentes compartimentos celulares dos neutrófilos. As NETs podem ser induzidas por diversos microrganismos, como a Leishmania, PMA, assim como fibras amiloides, moléculas proteicas insolúveis, dentre outros estímulos. A sinalização intracelular envolvida na netose é complexa e ainda não foi completamente elucidada para a maioria dos estímulos. Já foi demonstrado na literatura dois mecanismos de liberação das NETs: uma netose clássica, dependente da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela NADPH oxidase, e da descondensação da cromatina, através das enzimas peptidil arginina deaminase (PAD4), elastase e mieloperoxidase (MPO) e uma netose rápida, independente de ROS. Neste trabalho, nós demonstramos que os promastigotas de L. amazonensis induzem a netose clássica, dependente de um desequilíbrio redox celular, assim como por um mecanismo sensível à cloroamidina e atividade da elastase. Além disso, a Leishmania também induz a netose rápida que ocorre apenas 10 minutos após a interação do neutrófilo com o parasita. Nós evidenciamos que esse mecanismo rápido é dependente da atividade da elastase, mas independente da geração de ROS e cloroamidina. Outro aspecto que avaliamos foram os mecanismos de formação das NETs induzidas pela fibra amiloide A25T. Nossos resultados demonstraram que um desvio metabólico para a via das pentosefosfato (PF) é necessário para a formação das NETs induzidas pela fibra amiloide, já que a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), uma importante enzima da via das PF, fornece NADPH para a NADPH oxidase para a produção de superóxido e assim induzir a netose. Além disso, nós observamos que o ROS mitocondrial, que é independente da NADPH oxidase, não é eficaz em produzir NETs. Esses dados em conjunto fornecem novas evidências sobre como os dois mecanismos de netose, a via das PF e o metabolismo da glicose contribuem para um melhor entendimento sobre a formação das NETs induzidas pela Leishmania e pela fibra amiloide
Palavras-chave: Redes extracelulares de neutrófilos (NETs), L. amazonensis, fibra amiloide, espécies reativas de oxigênio (ROS) e via das pentose-fosfato
Abstract
The neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like structures composed by DNA, histones and proteins from different neutrophils compartments. NETs can be induced by several microorganisms, such as Leishmania, PMA, as well as amyloid fibrils, insoluble protein molecules, among other stimuli. The netosis involved in intracellular signaling is complex and has not yet been completely elucidated to most stimuli. It has been shown in the literature two mechanisms for NETs release: a classic netosis, dependent on the generation of reactive oxygen species (ROS) by NADPH oxidase, and decondensation of chromatin, through enzymes peptidyl deaminase arginine (PAD4), elastase and myeloperoxidase (MPO), and a rapid netosis, ROS-independent. In this work, we demonstrate that L. amazonensis promastigotes induce the classic netosis, dependent on a cellular redox imbalance, as well as a mechanism sensitive to chloroamidine and elastase activity. Furthermore, Leishmania also induces rapid netosis occurring only 10 minutes after neutrophils interaction with the parasite. We evidenced that this rapid mechanism is dependent on elastase activity but independent of ROS generation and chloroamidine. Another aspect evaluated here were those of NETs formation mechanisms induced by amyloid fibril A25T. Our results demonstrated that a metabolic shift to pentose-phosphate (PF) pathway are required for NETs formation induced by amyloid fibril, since the glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD), an important enzyme of PF pathway, provides NADPH to NADPH oxidase to produce superoxide and thus induce netosis. In addition, we observed that the mitochondrial ROS, which is NADPH oxidase independent, is not effective in producing NETs. Altogether, these data provides new evidence on how the two netose mechanisms, the PF pathway and glucose metabolism contribute to a better understanding of NETs formation induced by Leishmania and amyloid fibril.
Palavras-chave: Neutrophil extracellular traps (NETs), L. amazonensis, amyloid fibril, reactive oxygen species (ROS) and penthose-phosphate (PF) pathway.
Caracterização de componentes séricos e moléculas de sinalização na resposta inflamatória induzida pelo heme
Título
Título: Caracterização de componentes séricos e moléculas de sinalização na resposta inflamatória induzida pelo heme
Aluno(a): Rafael Cardoso Maciel Costa Silva
Orientador(es): Prof. Marcelo Torres Bozza
Resumo
O heme é uma molécula orgânica composta por um anel protoporfirínico com um átomo de ferro em seu centro. Possui atividade óxido-redutora de acordo com o estado oxidativo do átomo de ferro que o compõe. É o grupamento prostético de diversas enzimas sendo responsável pelo enlaçamento do oxigênio na hemoglobina. Conservado evolutivamente, o heme promove estresse oxidativo, através da propagação de espécies reativas de oxigênio (ROS), e induz diferentes efeitos inflamatórios, como um padrão molecular associado a dano (DAMP). Os vertebrados possuem diferentes ligantes séricos que irão interagir e mediar a detoxificação do heme liberado após eventos hemolíticos, patológicos ou fisiológicos. Esta tese foca nos efeitos inflamatórios do heme sobre macrófagos. Já foi descrito, que na ausência de ligantes séricos, o heme é capaz de ativar o receptor do tipo toll 4 (TLR4) in vitro levando a secreção de citocinas inflamatórias. Na presença de ligantes séricos, o heme não ativa TLR4, mas induz um aumento sinergístico sobre a secreção de citocinas pró-inflamatórias, quando os macrófagos são incubados concomitantemente com alguns agonistas de receptores de reconhecimento padrão (PRRs). Dados in vivo corroboram ambos os resultados in vitro. Assim, após uma triagem com os diferentes ligantes séricos conhecidos do heme, identificamos a albumina como a responsável pelo bloqueio na ativação do TLR4, pelo heme, em macrófagos. De forma interessante, a albumina também se mostrou crucial para suportar o efeito sinérgico do heme após incubação com agonistas de PRRs. Além disso, estabelecemos algumas diferenças mecanísticas em relação a ambos os efeitos do heme em macrófagos. Dentre essas diferenças, vale ressaltar a participação dos microdomínios lipídicos no efeito sinérgico, mas não na ativação de TLR4 pelo heme, enquanto a endocitose parece ser importante para a ativação de TLR4 mas não para o efeito sinérgico. Evidenciamos também a ativação das quinases Lyn e PYK2, da via de Syk, pela incubação com heme tanto na presença quanto na ausência de albumina. Além de elucidar algumas questões importantes, esta tese abre diversas perspectivas para se compreender os mecanismos pelos quais o heme exerce seus efeitos inflamatórios em macrófagos.
Palavras-chave: Heme; Syk; Macrófagos; Espécies Reativas de Oxigênio; Albumina
Abstract
Heme is an organic molecule composed of a protoporphyrin ring with an iron atom in its center. The oxidative state of the iron atom will determine the oxidation-reduction potentials of heme containing proteins. It is the prostetic group of many enzymes within organisms and is the main group associated to oxygen binding within hemoglobin. Conserved in almost all life forms, heme promotes oxidative stress and has many proinflammatory effects, as a damage associated molecular pattern (DAMP). As such, vertebrates express different serum ligands that are important as heme scavengers helping heme detoxification after pathological or physiological hemolysis. This thesis will focus on the inflammatory effects of heme on macrophages. It has already been described, in vitro, that heme activates Toll like receptor 4 (TLR4) on macrophages, in the absence of serum ligands. In the presence of serum ligands, heme is not able to activate TLR4, but induces a synergism over the pro-inflammatory cytokines secretion on macrophages activated with pattern recognition receptors (PRRs) agonists. In vivo datas support these two in vitro results. Through a screening with different serum ligands, we were able to determine albumin as the serum ligand responsible for the blockade of TLR4 activation and support of the synergistic effect of heme on macrophages. Besides that, we stablished some mechanistic differences associated with TLR4 activation and synergism induced by heme on macrophages. We showed that lipid rafts were important to the synergistic effects of heme, without influencing on TLR4 activation and that endocytosis had opposing effects, being important for the TLR4 activation. We demonstrated the activation, through phosphorylation, of the two kinases Lyn and Pyk2, as an activator and effector of the Syk pathway, respectively, in the presence and absence of albumin. The results presented in this thesis clarify some questions and opens different perspectives that could be important to understand the mechanisms by which heme mediates inflammatory effects on macrophages that will have systemic importance on different hemolytic diseases.
Palavras-chave: syk; Heme; Albumin
Estudo da netose na leishmaniose: Aspectos moleculares e o envolvimento na resistência e susceptibilidade à infecção
Título
Título: Estudo da netose na leishmaniose: Aspectos moleculares e o envolvimento na resistência e susceptibilidade à infecção
Aluno(a): Thiago Soares de Souza Vieira
Orientador(es): Profa Elvira Maria Saraiva Chequer Bou Habib
Resumo
“Estudo da netose na leishmaniose: Aspectos moleculares e o envolvimento na resistência e susceptibilidade a infecção” Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Imunologia e Inflamação do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes – UFRJ. Neutrófilos são os primeiros leucócitos a interagirem com Leishmania durante o repaste sanguíneo do vetor e a responderem contra o parasita no sítio da infecção, porém o papel dessas células nas leishmanioses é ainda controverso. Neutrófilos liberam para o meio extracelular um esqueleto de cromatina associado a proteínas granulares e citoplasmáticas (NET), os quais juntos aprisionam e matam microrganismos através de um mecanismo de morte celular denominado netose. Foi descrito anteriormente que a interação entre neutrófilos humanos e Leishmania amazonensis resulta na liberação de NET, a qual serve de armadilha e mata o parasita. No presente trabalho, nós evidenciamos que PI3K, independente de AKT, é requerida para a liberação de NET induzida pelo parasita, sendo que as principais isoformas envolvidas são PI3Kγ e PI3Kδ, as quais funcionam através de um mecanismo dependente e independente da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), respectivamente. Demonstramos que a ativação de ERK a montante de PI3Kγ aciona a netose dependente de ROS induzida pelo parasita. A inibição de PKC reduziu significativamente a liberação de NET induzida pelo parasita. A mobilização intracelular de cálcio, regulada por PI3Kδ, representa uma via alternativa independente de ROS estimulada pelo parasita durante a netose. Finalmente, a mobilização intracelular de cálcio e a geração de ROS são os principais reguladores da netose induzida pelo parasita. Outro aspecto abordado por esse trabalho foi a eficiência dos principais mecanismos microbicidas de neutrófilos em animais resistentes e suscetíveis a infecção por L. major. Independente do status de maturação, neutrófilos de camundongos suscetíveis são mais eficientes na geração de NET, a qual é caracterizada por fibras enriquecidas em elastase e está associada com uma abundante mobilização precoce de grânulos azurofílicos antes da liberação de NET. A indução de NET por L. major é independente de NADPH oxidase e dependente de elastase. Neutrófilos de animais resistentes internalizam promastigotas mais eficientemente e tem maior impacto sobre a sobrevivência do parasita, embora gerem NETs sem toxicidade para promastigotas. A toxicidade da NET de animais suscetíveis está associada com a maior composição de elastase e promastigotas deficientes em ISP2/ISP3 mostraram-se significativamente mais suscetíveis a NET de animais suscetíveis. Portanto, os resultados apresentados aqui contribuem para o melhor entendimento da sinalização durante a netose induzida pelo parasita em neutrófilos humanos. Além disso, nós apontamos que um balanço entre a netose e a fagocitose está associado com os fenótipos de resistência e susceptibilidade a infecção por L. major
Palavras-chave: Neutrófilos; NETs; Leishmania; sinalização; fagocitose;I SP2/ISP3
Abstract
“Exploring netosis on leishmaniasis: Molecular aspects of NET induction and role on resistance and susceptibility to infection” Doctorade thesis summary presented to the Imunologia e Inflamação posgraduation program at Instituto de Microbiologia Paulo de Góes – UFRJ. Neutrophils are the first leukocytes to interact and respond to the parasite at the site of inoculation, whereas the role of these cells on leishmaniasis is still controversial. Neutrophils release to the extracellular medium a chromatin scaffold associated with granular and cytoplasmic proteins, which together ensnare and kill microbes through a cell death mechanism named netosis. We have previously described that Leishmania amazonensis the release of neutrophil extracellular traps (NETs) by human neutrophils, which trap and kill the parasite. Here, we found that PI3K, independently of AKT, is required in netosis induced by the parasite and the main isoforms involved are PI3Kγ and PI3Kδ, which work in reactive oxygen species (ROS)- dependent and -independent ways, respectively. We demonstrated that activation of ERK downstream of PI3Kγ triggers ROSdependent parasite-induced netosis. Inhibition of PKC also significantly decreased parasiteinduced NET release. Intracellular [Ca2+], regulated by PI3Kδ, represents an alternative ROS-independent pathway of netosis stimulated by L. amazonensis. Finally, [Ca2+] mobilization and ROS generation are the major regulators of parasite-induced netosis. Another aspect of this work was the efficiency of the main microbicidal mechanisms of neutrophils in resistant and susceptible mice to Leishmania major. Regardless to maturation status, susceptible mice neutrophils are more efficient at generating NET, which is elastaseenriched and was found to be associated with an early abundant mobilization of azurophilic granules prior to NET release. L. major induction of NET is independent of NADPH oxidase and dependent of elastase. Resistant mice neutrophils uptake promastigotes more efficiently and control extracellular parasite survival via phagocytosis but generate NET with no toxicity to the parasite. Susceptible mice NET killing is associated with greater elastase presence and ISP2/ISP3 deficiency render significantly more parasite killing. Thus, results presented here contribute to a better understanding of the signaling behind netosis induced by interactions between Leishmania and neutrophils and point that a balance between neutrophil phagocytosis and NET generation is associated with resistance and susceptible phenotypes in L. major infection.
Palavras-chave: ISP2/ISP3; NETs; Leishmania
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