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DISSERTAÇÕES
O papel do receptor dectina-1 na imunidade inata ao fungo patogênico Pseudallescheria boydii.
Título
Título: O papel do receptor dectina-1 na imunidade inata ao fungo patogênico Pseudallescheria boydii.
Aluno(a): Yasmim Aurora Vieira Braga
Orientador(es): Prof(a). Rodrigo Tinoco Figueiredo
Resumo
As infecções fúngicas invasivas tem aumentado nas últimas décadas, representando uma importante causa de mortalidade e morbidade em indivíduos imunosuprimidos. Pseudallescheria boydii é um fungo oportunista causador de infecções invasivas em indivíduos imunocomprometidos, sendo, além disso, o principal agente causador de micetomas micóticos, condição que acomete indivíduos imunocompetentes. P. boydii é amplamente distribuído na natureza, encontrado principalmente como saprófita de águas de rios, solo, estrumes, lamas de esgoto e pântano. Sabe-se que receptores da imunidade inata desempenham um papel essencial no reconhecimento imune inato de fungos patogênicos. TLR2, TLR4 e Dectina-1 estão envolvidos na indução da produção de mediadores inflamatórios em resposta a fungos patogênicos. Além disso, o reconhecimento de fungos é capaz de ativar o inflamassomo, promovendo a produção de IL-1β e ativação de caspase-1 por um mecanismo mediado por NLRP3, ou ainda por mecanismos independentes de NLRP3 e dependentes da caspase-8, AIM2, ou ativação constitutiva da caspase-1. Contudo, o papel e a contribuição de diversos receptores da imunidade inata no reconhecimento e imunidade à infecção pelo P. boydii são largamente desconhecidos. Assim, investigamos o papel do receptor de β-glucanas, a Dectina-1, no reconhecimento imune inato de P. boydii. Nossos resultados demonstram que o reconhecimento de conídios de P. boydii por Dectina-1 e TLR4 promove a liberação de citocinas pró-inflamatórias e a fagocitose requer o reconhecimento mediado por Dectina-1 dos conídios de P. boydii por macrófagos. O processo de germinação de conídios começa em torno de 6h e 9h completando a morfogênese para diferenciação em hifas no tempo de 24h. P. boydii não é capaz de induzir a produção de ROS em macrófagos peritoneais murinos, o receptor Dectina-1 não foi necessário para a atividade fungicida/fungistática. Os conídios em repouso apresentaram baixa ligação a Dectina-1 Fc, sendo esta aumentada em 6h de germinação, atingindo um máximo de ligação em 9h. A liberação de IL-1β em resposta a P. boydii necessitou do reconhecimento mediado pela cooperação entre TLR4 e Dectina-1 e da ativação do inflamassomo dependente de NLRP3/caspase-1. Em um modelo experimental de infecção dérmica por inoculação de P. boydii, Dectina-1 é necessária para o controle da lesão durante a infecção. Nossos resultados demonstram que o receptor de β-glucanas, Dectina-1, desempenha um papel essencial no reconhecimento do fungo patogênico P. boydii. Deste modo, nossos resultados trazem uma contribuição importante para a compreensão das infecções causadas por esse fungo.
Palavras-chave: Pseudallescheria boydii; Reconhecimento imune inato;I nflamossomo;Dectina-1; TLR4
Abstract
Invasive fungal infections have increased in the last decades, representing an important cause of mortality and morbidity in immunosuppressed individuals. Pseudallescheria boydii is an opportunistic fungus that causes invasive infections in immunocompromised individuals, being also the main causative agent of mycetomas mycosis, a condition that affects immunocompetent individuals. P. boydii is widely distributed in nature, mainly found as saprophyte of rivers, soil, manures, sewage sludge and marshes. It is known that innate immunity receptors play an essential role in the innate immune recognition of pathogenic fungi. TLR2, TLR4 and Dectin-1 are involved in the production of inflammatory mediators in response to pathogenic fungi. In addition, fungal recognition is capable of activating the inflammasome, promoting the production of IL-1β and activation of caspase-1 by an NLRP3-mediated mechanism, or by NLRP3 independent mechanisms involving caspase-8 activation, AIM2 or constitutive activation of caspase-1. However the role and contribution of various receptors of innate immunity in the recognition and immunity to P. boydii infection are largely unknown. Thus, we investigated the role of the β-glucan receptor, Dectin-1, in the innate immune recognition of P. boydii. Our results demonstrate that the recognition of P. boydii conidia by Dectin-1 and TLR4 promotes the release of proinflammatory cytokines and phagocytosis of P. boydii conidida by macrophages requires Dectin-1-mediated recognition. The conidial germination begins around 6h and 9h, completing morphogenesis for differentiation in hyphae at 24h. P. boydii is not able to induce ROS production in murine peritoneal macrophages, and Dectin-1 receptor was not required for fungicide/fungistatic activity. At rest, conidia had a low binding to Dectin-1 Fc and Dectin-1 Fc binding was increased after 6h germination reaching a maximum binding in 9h. Release of IL-1β in response to P. boydii required recognition mediated by the co-operation between TLR4 and Dectin-1 and NLRP3/caspase-1 activation . In an experimental model of skin infection by inoculation of P. boydii, Dectin-1 is required for the control of the lesion during infection. Our results demonstrate that the β-glucan Dectin-1 receptor plays an essential role in the recognition of the pathogenic fungus P. boydii. Thus, our results make an important contribution to understanding the infections caused by P. boydii.
Keyword: Pseudallescheria boydii; immune recognition; Inflamosmome; Dectin-1; TLR4
Perfil de linfócitos T tecido-específico na homeostasia e durante a resposta imunológica em modelo experimental (murino) de câncer de mama metastático.
Título
Título: Perfil de linfócitos T tecido-específico na homeostasia e durante a resposta imunológica em modelo experimental (murino) de câncer de mama metastático.
Aluno(a): Marina Vieira Agostinho Pereira
Orientador(es): Prof(a). Adriana Cesar Bonomo
Resumo
No cenário de constante busca ao entendimento dos mecanismos de desenvolvimento e estabelecimento metastático o microambiente tumoral desempenha importante papel pró/anti colonização tumoral. Como integrante desse nicho tumoral temos as células do sistema imune. Quanto ao papel dos linfócitos T nesse contexto, nosso grupo mostrou, no modelo de tumor de mama 4T1, que a metástase óssea ocorre de forma dependente de linfócitos T CD4 RANKL+ que preparam o nicho ósseo para a chegada do tumor. Entretanto, dados da literatura sugerem que linfócitos T CD4 IL4+ em modelo de tumor de mama são essenciais para que a metástase pulmonar ocorra. Esses dados denotam a importância das células T para o estabelecimento da metástase, bem como despontam a especificidade tecidual das células T, que alteraram seu fenótipo de acordo com o nicho metastático. Contudo, os trabalhos citados utilizam modelos animais distintos. Logo, nos perguntamos como estaria o perfil dos linfócitos nos diferentes órgãos alvo da metástase em um mesmo sistema, considerando que cada tecido possui sua própria homeostasia e possíveis alterações no microambiente se tornam potenciais marcadores preditores de metástase auxiliando no diagnóstico precoce e em futura abordagem terapêutica. Através da citometria de fluxo observamos o percentual de células T CD4+ e T CD4- produtoras das citocinas TNFα, INFγ, IL13, RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF Análises por bioinformática dos dados mostram que os grupos controles apresentam diferentes perfis de citocinas em cada órgão tanto para células TCD4+ quanto TCD4-. O mesmo ocorre quando os animais inoculados com o tumor por 17 e 23 dias, quando há colonização metastática em todos os órgãos. No entanto, no dia 17 os perfis de linfócitos CD4+ ou CD4- em cada órgão é modificado. A análise estatística pontual de cada citocina pelos gráficos de barra mostra que durante a homeostasia TNFα é a citocina com produção predominante, tanto em células T CD4+ quanto em T CD4-, em todos os órgãos, exceto no fígado e tende a aumentar mesmo antes da colonização tumoral. Observamos que em todos os órgãos em D17 as citocinas RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF são alteradas aumentando o percentual de células produtoras com a progressão do tumor. Linfócitos T CD4+ aumentam a produção de RANKL no linfonodo, baço, fígado e medula. Enquanto GM-CSF aumenta no baço, fígado, pulmão e medula. O percentual de células TCD4+ produtoras de IL13 em D17 aumenta apenas no baço, pulmão e fígado, com destaque nas TCD4- no pulmão e no fígado. As células TCD4- também apresentaram maior variação das citocinas RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF, com destaque para aumento percentual de células produtoras dessas citocinas principalmente no baço e no fígado. Acreditamos que estes dados possam ser usados para prever metástases sítio específicas em seres humanos. Palavras-chave: câncer, metástase; linfócitos T; microambiente metastático
Palavras-chave: linfócitos T;microambiente metastático;câncer;metástase
Abstract
In this scenario of constant search for understanding the mechanisms of tumor development and establishment, the tumor microenvironment plays an important role. As part of the tumor niche there are the cells of the immune system. Regarding the role of T lymphocytes in this context, our group showed, in the 4T1 breast tumor model, that bone metastasis isdepends on RANKL + CD4 T lymphocytes that prepare the bone pre-metastatic niche for tumor arrival. Literature data suggest that CD4 IL4 + T lymphocytes in a different model of breast tumor, are essential for pulmonary metastasis. These data denote the importance of T cells for the establishment of metastasis as well as the tissue specificity of T cells that have different phenotypes according to the metastatic niche. However, the cited works use different animal models. Therefore, we asked how the lymphocyte profile in the different target organs of the metastases in the same system would be, considering that each tissue has its own homeostasis and antigen not microenvironment become potential predictive markers of metastasis, adding in early diagnosis and in future therapy approaches. The percentage of the cytokines TNFα, INFγ, IL13, RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF produced by CD3 + CD4 + and CD3 + CD4- T cells was obtained by flow cytometry, Bioinformatic analyzes of the data show different cytokine profiles in each organ for both CD4 + and TCD4- cells. The same occurs when the data of the animals inoculated with the tumor by 17 and 23 days. The statistical analysis of each cytokine by bar graphs shows that in homeostasis, TNFα is the predominant, both in CD4 + T cells and in CD4 T, in all organs, except in the liver, and tends to increase during tumor colonization. We observed that all organs in D17 alter RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF production, increasing the percentage of producing cells with tumor progression, although still before metastatic colonization. Percentages of CD4 producing RANKL in the lymph node, spleen, liver and marrow increase, while GM-CSF increases in D17 in the spleen, liver, lung and marrow. Percentage of IL13-producing CD4+ cells in D17 increases in spleen, lung and liver. and TCD4- cells also increase the production of this cytokine. TCD4 – cells showed the greatest variation on the cytokines RANKL, IL17F, IL17A, GM-CSF, with highlight to the percentage increase of cytokine producing cells mainly in the spleen and liver. Key words: cancer; metastasis; T lymphocytes; metastatic microenvironment
Keyword: cancer;metastasis;T lymphocytes;metastatic microenvironment
Indução da tolerância a transplante de pele com uso de LLactis como adjuvante tolerogênico.
Título
Título: Indução da tolerância a transplante de pele com uso de LLactis como adjuvante tolerogênico.
Aluno(a): Luciano Sanuto Leite
Orientador(es): Prof(a). Adriana Cesar Bonomo
Resumo
Os diferentes tipos de transplantes de órgãos sólidos e tecidos compartilham semelhante dificuldade, relacionadas as incompatibilidades do Complexo Histocompatibilidade Maior (MHC) e Antígenos de Histocompatibilidade Menor (MiHA) que desencadeiam uma forte resposta do sistema imune adquirido ao órgão transplantado. Hoje os fármacos utilizados obtêm grande sucesso em suprimir esta resposta e manter a sobrevida do enxerto, mas as custas de diversas patologias secundarias. Com o objetivo em suprimir a resposta do sistema imune adquirido ao MiHA especificamente o HY, utilizamos um protocolo de tolerância oral, visando manter a sobrevida do enxerto e evitar as complicações secundarias, através da especificidade ao antígeno. Foi utilizado um protocolo de Terapia Combinada (TC) (extrato do baço do doado + bactéria L. Lactis) em modelo de transplante de pele em camundongos C57BL/6. Os animais machos foram os doadores e as fêmeas as receptoras. A TC foi administrada por um período de 4 dias consecutivos. Primeiro avaliamos a dose/resposta da terapia combinada, foi administrado diferentes doses para os animais (50μg/ml, 5μg/ml e 0,5μg/ml) em conjunto com L.Lactis. Os animais tratados tiveram uma sobrevida contínua e não tratado perdeu o enxerto. Todas as doses foram eficientes na manutenção da sobrevida do enxerto, demonstrando desta forma a eficácia da terapia combinada. Depois analisamos quais células estariam envolvidas na indução da sobrevida do enxerto. Vinte dias após o Tx os animais foram sacrificados e as células foram analisadas, os animais tratados, apresentaram uma frequência elevada de duas populações de células Treg (CD4+CD25+Foxp3+ e CD4+CD25-Foxp3+) na pele em comparação ao não tratado. Confirmando assim o efeito protetor para a sobrevida do Tx dos animas tratados. Partindo deste resultado, foi necessário caracterizar quais células seriam responsáveis para induzir as Treg na pele. Após um período de 20 dias ao Tx os animais foram sacrificados e realizada a análise das células do baco e linfonodo mesentérico. Das analises realizadas, não foi encontrado nenhuma diferença significativa na população de células dendríticas no linfonodo mesentérico e baço. Já que a as células dendríticas foram descartadas, a segunda opção como apresentadora de antígeno seria a célula B, tendo como base os resultados publicados por Mercadantes et al. (2014). Foi realizado um experimento após 20 dias XII ao Tx, os animais foram sacrificados e seu baço e linfonodo mesentérico analisado. Os resultados demonstraram elevada população de células B transicional, sendo estas as possíveis células que estariam induzindo as populações de células Tregs. Logo após foi realizado um experimento para analisar a relevância do linfonodo mesentérico na terapia combinada. Os animais foram nefrectomizados e os depois tratados com a terapia combinada. A ausência do linfonodo mesentérico levou a rejeição do enxerto dos animais tratados. Conclui-se que esta terapia combinada induz a tolerância oral, os linfócitos B transicionais parecem ter uma participação relevante neste fenômeno e que o linfonodo mesentérico é fundamental para este mecanismo de indução.
Palavras-chave: transplante de pele; LLactis; histocompatibilidade
Abstract
Envolvimento do metabolismo do citrato nas funções leishmanicidas de macrófagos.
Título
Título: Envolvimento do metabolismo do citrato nas funções leishmanicidas de macrófagos.
Aluno(a): Lara Kauss
Orientador(es): Prof(a). Heitor Affonso de Paula Neto
Resumo
As leishmanioses são consideradas endêmicas em mais de 80 países, onde cerca de 2 milhões de casos e 7 mil mortes são reportados todos os anos, tornando-a uma das mais importantes dentre as doenças tropicais negligenciadas. As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania, que mantem seu ciclo de vida entre um hospedeiro mamífero e um vetor invertebrado. A eliminação dos parasitos intracelularesdepende da ativação dos mecanismos efetores dos macrófagos, especialmente a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (EROs). Estudos recentes demonstraram um importante papel do metabolismo de citrato para a produção desses mediadores por macrófagos ativados in vitro com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) e interferon-γ (IFN-γ).De acordo com esses estudos, o metabolismo de citrato serviria como fonte importante de NADPH, um co-fator para a produção de EROs e NO. No entanto, a participação dessa via metabólica para a produção desses mediadores e a eliminação de patógenos intracelulares em um modelo de infecção nunca foi testado. O objetivo de nosso estudo foi, portanto, avaliar a contribuição do metabolismo de citrato para a função leishmanicida de macrófagos. Além disso,nos propusemos a testar se a adição de citrato exógeno seria capaz de potencializar a eliminação de leishmania por macrófagos infectados. Nossos resultados demostraram que a inibição farmacológica da enzima ATP-citrato liase (ACYL), uma enzima chave da via metabólica do citrato, aumentousignificativamente a porcentagem de infecção e o número de parasitos intracelulares em macrófagos infectados. O tratamento também reduziu significativamente a produção de NO pelos macrófagos, demonstrando a importância da via metabólica do citrato na função leishmanicida dos macrófagos. Em adição, testamos a participação da via das pentoses nesse processo, uma vez que essa via é classicamente uma fonte de NADPH. A inibição da enzima chave da via das pentoses, a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) com o inibidor 6-AN (6-aminonicotinamida), aumentou significativamente a porcentagem e o número de leishmanias nos macrófagos infectados e reduziu drasticamente a produção de NO, sugerindo que essa via é mais relevante para a produção desse mediador.Por fim, nossos resultados sugerem que a suplementação com citrato exógeno é capaz de reduzir a porcentagem de infeção e o número de parasitos nos macrófagos infectados, além de aumentar a produção de NO. Em conjunto, nossos dados mostram, pela primeira vez, a relevância da via metabolica do citrato para a função leishmanicida de macrófagos e ainda sugerem que a adição de citrato pode auxiliar na eliminação de parasitos por essas células.
Palavras-chave: macrófagos; Leishmania amazonensis; Leishmania major; ATP-citrato liase; glicose-6-fosfato desidrogenase; óxido nítrico
Abstract
Leishmaniases are considered endemic diseases in over 80 countries, where 2 million cases and 7 thousand deaths are reported every year, being recognized as one of the most important tropical neglected diseases.These diseases are caused by protozoans of the Leishmania genre, which keep their life cycles between a mammal host and an invertebrate vector. Intracellular parasite elimination depends upon the activation of effector mechanisms of macrophages, especially nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production. Recent studies have shown animportant role for citrate metabolism in the production of these mediators by macrophages activated in vitro with bacterial lipopolysaccharide (LPS) and interferon-γ (IFN-γ). According to these studies, citrate metabolism would provide a source for NADPH, a co-factor for the production of both NO and ROS. However, the involvement of this metabolic pathway in the production of these mediators and the elimination of intracelular pathogens in an infection model has never been tested. Our aim was, therefore, to evaluate the contribution of citrate metabolism to the leishmanicidal functions of macrophages. Additionally, we tested whether exogenous citrate would potentiate the elimination of leishmania by infected macrophages. Our results show that the pharmacological inhibition of ATP-citrate lyase (ACLY), a key enzyme of citrate metabolism, significantly increased the percentage of infected macrophages and the number of intracellular parasites. This treatment also reduced NO production, demonstrating the importance of citrate metabolism to the leishmanicidal functions of macrophages.In addition, we tested the participation of the pentose-phosphate shunt (PPP) in this process, since this is a metabolic pathway classically involved in NADPH production. Inhibition of the key PPP enzyme, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) with 6-AN (6-aminonicotinamide), significantly increased the percentage of infected macrophages and the number of leishmania, with a drastic reduction in NO production, suggesting a more relevant role for this pathway in this process. Finally, our results suggest that exogenous citrate is able to reduce the percentage of infected macrophages as well as the number of parasites per macrophage, with a concomitant increase in NO production. Taken together, our data show for the first time the relevance of citrate metabolism for the leishmanicidal functions of macrophages and also suggest that citrate supplementation may help in parasite elimination by these cells.
Keyword: macrophages; Leishmania amazonensis; Leishmania major; ATP-citrate lyase; glucose-6-phosphate dehydrogenase; nitric oxide
Avaliação do perfil de células t regulatórias em diferentes linhagens de camundongos e sua implicação na resposta alérgica pulmonar.
Título
Título: Avaliação do perfil de células t regulatórias em diferentes linhagens de camundongos e sua implicação na resposta alérgica pulmonar.
Aluno(a): Carolina Trindade de Azevedo
Orientador(es): Prof(a). Priscilla Christina Olsen
Resumo
As células T regulatórias (Tregs) são importantes na proteção contra respostas a antígenos inócuos, como os alérgenos, controlando a resposta Th2, mecanismo que parece comprometido em indivíduos asmáticos. Diferentes linhagens de camundongos isogênicos também apresentam distintas respostas imunológicas e particularidades na suscetibilidade aos variados protocolos experimentais. Neste trabalho investigaram-se as diferenças na frequência dos subtipos de células Treg entre as linhagens A/J, BALB/c, e C57BL/6, em condições normais e mediante indução de asma alérgica com ovoalbumina (OVA). Duas sensibilizações subcutâneas de uma solução contendo 50 μg de OVA e 5 mg de alúmen nos dias 0 e 14 e desafios intranasais nos dias 19, 20, 21 e 22 com uma solução de OVA (25 μg/25 μL de salina) induziram alterações características do quadro asmático como hiperreatividade das vias aéreas, inflamação e produção de citocinas Th2 (IL-4, IL13, IL-5 e IL-33) no pulmão somente nas linhagens A/J e BALB/c, avaliados por pletismografia de corpo inteiro invasiva, citometria e ELISA, respectivamente. C57BL/6 apresentou maior frequência de células Treg CD4+CD25+ Foxp3+ no BAL e no linfonodo mediastinal (mLN) após desafio com OVA. O estímulo antígeno-específico in vitro de células do mLN de animais desafiados com OVA induziu maior produção de células Treg CD4+ IL-10+ pela linhagem A/J, e CD4+CD25+ Foxp3+ por C57BL/6. A linhagem A/J também apresentou naturalmente maior frequência de células CD4+ IL-10+ no pulmão de camundongos que nunca foram sensibilizados nem desafiados, comparada às demais linhagens, acompanhada de maiores frequências de células CD4+ IL-4 + . As diferenças observadas quanto às frequências dos subtipos de células Treg associadas à suscetibilidade dos animais avaliados à asma experimental sugerem que células Treg CD4+CD25+ Foxp3+ e CD4+ produtoras de IL-10 podem exercer diferentes papéis no controle da asma, visto que níveis elevados de células CD4+ IL-10+ foram incapazes de proteger camundongos A/J desafiados com OVA da inflamação alérgica pulmonar, enquanto maiores frequências de células CD4+CD25+ Foxp3+ em camundongos C57BL/6 parecem protegê-los efetivamente. De forma semelhante aos indivíduos asmáticos, a falta de uma resposta reguladora eficiente e a suscetibilidade ao desenvolvimento de asma experimental dos camundongos A/J sugerem ainda que esta linhagem deve ser preferencialmente escolhida em modelos experimentais de asma. Palavras chave: asma;, alergia; células T regulatórias; inflamação;
Palavras-chave: asma; alergia; células T regulatórias; inflamação
Abstract
Regulatory T cells (Tregs) are important in protecting against responses to innocuous antigens, such as allergens, by controlling the Th2 response, a mechanism that appears to be compromised in asthmatic individuals. Different isogenic mouse strains also have distinct immunological responses and susceptibility to the experimental protocols used to develop lung allergic inflammation. In this work we investigated the differences in the frequence of Treg cell subtypes between A/J, BALB/c, and C57BL/6, under normal conditions and through induction of allergic asthma with ovalbumin (OVA). Two subcutaneous sensitizations of a solution containing 50 μg of OVA and 5 mg of alum on days 0 and 14 and intranasal challenges on days 19, 20, 21 and 22 with OVA solution (25 μg/25 μl of saline) induced asthma characteristic changes such as airway hyperreactivity, inflammation and production of Th2 cytokines (IL-4, IL-13, IL-5 and IL-33) in the lungs only in the A/J and BALB/c strains, evaluated by invasive whole body plethysmography, cytometry and ELISA, respectively. C57BL/6 presented higher frequency of CD4+CD25+ Foxp3+ Treg cells in BAL and mediastinal lymph node (mLN) after the OVA challenge. In vitro antigen-specific stimulation of mLN cells from OVA-challenged animals induced higher production of CD4+ IL-10+ Treg cells by A/J strain, and CD4+CD25+ Foxp3+ by C57BL/6. A/J strain also naturally showed a higher frequency of CD4+ IL-10+ cells in the lungs of naive mice compared to the other strains, accompanied by higher frequencies of CD4+ IL-4 + cells. The observed differences in the frequencies of Treg cell subtypes associated with the susceptibility of the animals to experimental asthma suggest that CD4+CD25+ Foxp3+ and IL-10-producing CD4+ Treg cells may play different roles in asthma control, since elevated levels of CD4+ IL-10+ cells were unable to protect OVA-challenged A/J mice from lung allergic inflammation, while higher frequencies of CD4+CD25+ Foxp3+ cells in C57BL/6 mice appear to effectively protect them. Similar to asthmatic individuals, the lack of an efficient regulatory response and susceptibility to the development of experimental asthma in A/J mice further suggests that this strain should preferably be chosen in experimental models of asthma. Key words: asthma; allergy; regulatory T cells; inflammation;
Keyword: asthma; allergy;regulatory T cells; inflammation
O papel da disfunção mitocondrial na ativação do inflamassomo em resposta ao fungo patogênico aspergillus fumigatus.
Título
Título: O papel da disfunção mitocondrial na ativação do inflamassomo em resposta ao fungo patogênico aspergillus fumigatus.
Aluno(a): Alexander Goncalves da Silva
Orientador(es): Prof(a). Rodrigo Tinoco Figueiredo
Resumo
Os fungos filamentosos do gênero Aspergillus spp incluem diversas espécies capazes de causar infecções humanas. Particularmente, a espécie A. fumigatus, que se constitui no principal agente causador de infecções pulmonares invasivas, é um dos principais agentes causadores de infecções pulmonares invasivas em pacientes imunosuprimidos, e estas infecções apresentam altas taxas de mortalidade. Do reconhecimento e controle do fungo participam receptores da imunidade inata, como Dectina-1 e o complexo inflamassomo Nlrp3, que é responsável pela secreção de citocinas como a IL-1β. A ativação do inflamassomo Nlrp3 pode ocorrer em função de diversos estímulos, como RNA bacteriano, ATP extracelular, ou cristais de ácido úrico. Danos na mitocôndria são sugeridos como uma das formas da liberação de ROS mitocondrial para a ativação do inflamassomo. Este trabalho teve como objetivo observar o papel da disfunção mitocondrial na liberação de ROS mitocondrial e ativação do inflamassomo Nlrp3, frente ao estímulo de macrófagos murinos com A. fumigatus. Macrófagos peritoneais murinos obtidos de camundongos selvagens ou Clec7a-/- (knockouts para Dectina-1) foram estimulados com conídios de A. fumigatus e a viabilidade mitocondrial foi observada através da microscopia confocal, que também foi utilizada para observar se ocorre perda da viabilidade mitocondrial quando o fungo não está mais vivo e se ROS mitocondrial causariam essa perda. Mensuramos a liberação de ROS mitocondrial por meio da técnica de citometria de fluxo e testamos se a inibição de ROS mitocondrial causaria uma diminuição da secreção de IL-1β, utilizando ELISA. Observamos que macrófagos peritoneais Clec7a-/- não apresentaram despolarização da membrana mitocondrial após a estimulação com conídios de A. fumigatus, ao contrário dos controles wild type. Observamos ainda a liberação de ROS mitocondrial após a perda do potencial de membrana mitocondrial. A secreção de IL-1β não foi estimulada na ausência de ROS mitocondrial. Os resultados sugerem que o receptor Dectina-1 reconhece o A. fumigatus, causando a disfunção mitocondrial, o que fará com que ocorra a liberação de ROS mitocondrial, que será o sinal responsável pela ativação do inflamassomo Nlrp3, ocasionando a secreção de IL-1β.
Palavras-chave: Aspergillus fumigatus;Inflamassomos;Mitocôndria-Imunologia;Mitocôndria-Patologia
Abstract
The filamentous fungi of the genus Aspergillus spp include several species capable of causing human infections. Particularly, the species A. fumigatus, which is the main agent causing invasive pulmonary infections, is one of the main agents of invasive pulmonary infections in immunosuppressed patients, and these infections have high mortality rates. As a form of recognition and control of the fungus, recognition is performed through receptors of innate immunity, including Dectin-1 and the inflammatory complex Nlrp3, the latter responsible for the secretion of cytokines such as IL-1β. Activation of Nlrp3 inflammasome can occur due to several stimuli, such as bacterial RNA, extracellular ATP, uric acid crystals, among others. Damage to mitochondria is suggested as one of the forms of mitochondrial ROS release for the activation of inflammasome. This work aimed to observe the role of mitochondrial dysfunction in the release of mitochondrial ROS and activation of Nlrp3 inflammasome in response to the stimulation of murine macrophages with A. fumigatus. Murine peritoneal macrophages obtained from wild mice or Clec7a-/- (Dectin-1 knockouts) were stimulated with A. fumigatus conidia and mitochondrial viability was observed by confocal microscopy, which was also used to observe whether loss of mitochondrial viability occurs when the fungus is no longer alive and also whether mitochondrial ROS would cause such loss. We measured the release of mitochondrial ROS by means of the flow cytometry technique and analyzed whether the inhibition of mitochondrial ROS would cause a decrease in the secretion of IL-1β by use of the ELISA technique. We observed that Clec7a-/- peritoneal macrophages do not exhibit mitochondrial membrane depolarization. Mitochondrial ROS was released upon loss of mitochondrial membrane potential and Il-1β secretion was not stimulated in the absence of mitochondrial ROS. These results suggest that the Dectin-1 receptor recognizes A. fumigatus, causing mitochondrial dysfunction, which will cause the release of mitochondrial ROS, which will be the signal responsible for the activation of the Nlrp3 inflammasome, leading to the secretion of IL-1β.
Keyword: Aspergillus fumigatus;Inflammasomes;Mitochondria-Immunology;Mitochondria-Patology
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