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DISSERTAÇÕES
Neutrófilos RANKL+: caracterização e implicações no nicho pré-metastático ósseo
Título
Título: Neutrófilos RANKL+: caracterização e implicações no nicho pré-metastático ósseo
Aluno(a): Triciana Goncalves da Silva
Orientador(es): Profa. Adriana Cesar Bonomo
Resumo
O câncer de mama é a neoplasia maligna mais frequente entre as mulheres brasileiras, podendo gerar focos metastáticos em órgãos distantes. No caso específico de metástases ósseas, estas representam uma causa importante de morbidade, ocorrendo em 70% das pacientes com metástase. Normalmente, o metabolismo ósseo é bem regulado, entretanto, nas metástases ósseas esse balanço é rompido, ativando a degradação óssea excessiva com liberação de fatores de crescimento que nutrem as células tumorais, que por sua vez, liberam diversos fatores no microambiente ósseo que induzem a diferenciação de osteoclastos, estabelecendo uma alça de alimentação positiva entre a degradação óssea e o crescimento tumoral conhecido como ciclo vicioso da metástase óssea. Nosso grupo adicionou um passo a mais ao ciclo vicioso. No modelo experimental de tumor de mama mostramos que linfócitos Th17 RANKL+ são essenciais na geração do microambiente ideal para o estabelecimento das metástases ósseas, sendo responsáveis pela indução de doença osteolítica pré-metastática, estabelecendo assim o nicho pré-metastático. Surpreendentemente, a perda óssea induzida por células T é precoce e intensa com diminuição de 50% da massa óssea trabecular em apenas 6 dias. Porém, linfócitos T representam 2-5% das células da medula óssea, e não acreditamos que essa população sozinha seja responsável por essa perda óssea tão agressiva. Recentemente, foi descrito que neutrófilos em condições inflamatórias expressam RANKL e são capazes de induzir a formação de osteoclastos funcionais in vitro. No nosso modelo, linfócitos RANKL+ secretam IL17, que é relacionada com neutrófilos e essas células representam 35% das células da medula óssea. Nos perguntamos se esses neutrófilos seriam candidatos que dariam a alça de amplificação para o fenômeno observado. Mostramos que neutrófilos RANKL+ estão presentes nos ossos em condições fisiológicas independentemente de linfócitos T e preferencialmente nos ossos trabeculares. No entento, neutrófilos RANKL+ aumentam em número absoluto e relativo já no 3° dia após o inóculo do tumor, dobrando no 6° dia. Em paralelo, também observamos aumento de neutrófilos RANK+. Através do ensaio de osteoclastogênese in vitro, demonstramos que neutrófilos de medula óssea de animais naives e de animais inoculado com tumor são capazes de induzir a diferenciação de osteoclastos de maneira dependente de RANKL, já que na presença de OPG esse efeito foi abolido. Neutrófilos RANKL+ da medula óssea de animais naives expressam citocinas pró e anti-inflamatórias e nos de animais no 6° dia após o inóculo de células tumorais esse perfil de expressão é alterado, com diminuição da expressão de IL10 e aumento de IL17A e TNFα. Também demonstramos que neutrófilos RANKL+ expressam moléculas relacionadas à interação com linfócitos T e que em animais portadores de tumor essas células aumentam a expressão de CD40. Além disso, em ensaios in vitro e nos experimentos de transferência de linfócitos T para animais NUDEs, observamos que ao contrário dos linfócitos T de animais naives, linfócitos T primados pelo tumor induzem aumento de neutrófilos RANKL+, mais pronunciado na presença de linfócitos T CD8 do que T CD4. Em resumo, nossos resultados sugerem que neutrófilos RANKL+ estão presentes principalmente nas regiões de osso trabecular em condições fisiológicas e durante a progressão tumoral. Antes do aparecimento das metástases ósseas há aumento da expressão de RANKL e RANK em todos os estágios de maturação granulocítica no microambiente ósseo e esses neutrófilos são capazes de induzir a diferenciação de osteoclastos in vitro. Além disso, essas células sofrem influência de fatores presentes na medula óssea de animais com tumor, que modulam o seu fenótipo e linfócitos T educados pelo tumor são capazes de induzir o aumento de neutrófilos RANKL+, sendo os linfócitos T CD8 mais eficientes.
Palavras-chave: Metástase óssea. Osteólise. Neutrófilos.
Abstract
Breast cancer is the most common malignancy among Brazilian women and may give rise to metastatic foci in distant organs. Bone metastases represent an important cause of morbidity, occurring in 70% of patients with metastatic disease. Normally bone metabolism is tightly regulated, however, in bone metastasis this balance is disrupted, triggering excessive bone degradation, which releases growth factors that will nourish tumor cells. These cells, in turn, will release a variety factors in bone microenvironment that will induce osteoclast differentiation, establishing a positive feedback between bone degradation and growth tumor, known as the vicious cycle of bone metastasis. Our group added one more step to the vicious cycle. In a breast cancer experimental model, we showed that Th17 RANKL+ lymphocytes are essential to induce the ideal microenvironment to establishment bone metastases, being responsible for induction of osteolytic disease in pre-metastatic niche. In our model we observed early bone loss, in 6 days after inoculum of tumor cells we observed a 50% decrease in bone trabecular mass. But, lymphocytes represent a 2-5% of total population in bone marrow, and it´s hard to believe that this small population alone are responsible for this aggressive bone loss. Recently, it has been described that neutrophils in inflammatory conditions express RANKL and RANK and are able to induce functional osteoclasts in vitro. In our model, RANKL+ lymphocytes secrete IL17, that is close related to neutrophils which represent 35% of total bone marrow cells. We asked if RANKL+ neutrophils could be the cells working on a amplification loop for the observed phenomenon. First we investigated if RANKL+ neutrophils were present in bones in physiological conditions. We observed no difference in the distribution of total neutrophils between cortical and trabecular bones, but RANKL+ neutrophils are preferentially in trabecular bones. In accordance to our prediction we observed a significant increase in RANKL+ neutrophils in the bone marrow of animals after 3 days of inoculation of tumor cells, which became even greater on the 6th day. RANK+ neutrophils were also increased in the bone marrow of tumor inoculated animals. Furthermore, in naïve mice RANKL is expressed in all stages of maturation and this profile is maintained in animals inoculated with tumor, but with significant increase in immature cells. As for RANK, it appears in immature neutrophils and increases expression during the maturation process. RANKL+ neutrophils are able to induce osteoclasts differentiation in a RANKL dependent manner, since in the presence of OPG this effect was abolished. RANKL+ neutrophils from naïve animals expresses pro and anti-inflammatory cytokines and in animals on 6th day after tumor inoculum this profile is altered, with decreased expression of IL10 and increased of IL17A and TNFα. We also demonstrated that RANKL+ neutrophils express molecules related to interaction with T cells on the 6th day after tumor inoculum these cells increase CD40 expression. Furthermore, in vitro assays and in T lymphocytes transfer to NUDEs, we observed that, unlike T cells from naive mice, tumor primed T cells induced increase in RANKL+ neutrophils. In vitro, induction of RANKL+ neutrophils was more pronounced in the presence of CD8 than CD4 lymphocytes. Our results suggest that bone marrow RANKL+ neutrophils are mainly distributed in the trabecular region under physiological conditions as well as during tumor progression. These cells induce osteoclastogeneses in vitro and, before tumor metastases to bone, there is an increase in RANKL expression in granulocytes in all stages of maturation. Factors secreted in the bone marrow will modulate granulocytes phenotype and tumor-educated T lymphocytes, especially CD8 lymphocytes, induce an increase in the number of RANKL+ neutrophils.
Keywords: –
Análise fenotípica linfócitos T gamma/delta na mielopatia associada à infecção pelo vírus linfotrópico para células T humanas do tipo 1 (HTLV-1).
Título
Título: Análise fenotípica linfócitos T gamma/delta na mielopatia associada à infecção pelo vírus linfotrópico para células T humanas do tipo 1 (HTLV-1).
Aluno(a): Raquel Cavalcanti de Albuquerque
Orientador(es): Profa. Juliana Echevarria Neves de Lima
Resumo
O vírus linfotrópico para células T humano do tipo 1 (HTLV 1) foi o primeiro retrovírus a ser relacionado ao desenvolvimento de doenças em humanos. Ele infecta células T CD4+ e estima-se que cerca de 10 a 20 milhões de pessoas estão infectadas em todo mundo, sendo que cerca de 1 a 5 % desenvolvem alguma das doenças associadas à essa infecção. As principais doenças relacionadas são a leucemia T do adulto e a mielopatia associada ao HTLV 1/paraparesia espástica tropical (MAH/PET), que é uma doença de caráter inflamatório do sistema nervoso central cujo sintoma é a perda progressiva da capacidade motora. As células T γδ são linfócitos T que possuem um TCR γδ que, diferentemente do TCR expresso pelos linfócitos T αβ, não é restrito ao complexo MHC/peptídeo, podendo ser ativado por diferentes antígenos, como lipídeos e fosfoantígenos. Essas células podem apresentar capacidade citotóxica e imunomodulatória e estão associadas a uma resposta imune eficaz a diversos patógenos. Diversos trabalhos também demonstram a participação dessas células em diversas doenças de caráter inflamatório. Assim, no presente estudo analisamos a população de linfócitos T de sangue periférico obtidos de pacientes portadores do HTLV-1 a fim de compreender o desenvolvimento e a progressão da mielopatia associada ao HTLV-1. Os resultados demonstram que não há nenhuma alteração no percentual das células T γδ em pacientes portadores do HTLV-1 assintomáticos ou sintomáticos, bem como nas subpopulações V1 + ou V2 + . Também não foram observadas alterações no percentual de células CD27+ , molécula associada à memória imunologica e produção de citocinas. Entretanto, observamos importantes alterações no perfil de proteínas associadas à função citotóxica dessas células nos indivíduos infectados com HTLV-1. Identificamos uma redução no percentual de células expressando granzima B mas, surpreendentemente, detectamos aumento na expressão do RNA mensageiro para granzima B, sugerindo que há um aumento da secreção dessa molécula. Além disso, observarmos aumento da expressão dos receptores associados à função citotóxica NKp30 e NKG2D. Também observamos um aumento no percentual de células T γδ produtoras de IFN-γ nos indivíduos infectados. Em conjunto nossos dados demonstram que, apesar de não infectar os linfócitos T γδ in vivo, a infecção com HTLV-1 leva a alterações fenotípicas nessa população, assim, é possível que haja o envolvimento dessas células no controle da infecção ou no desenvolvimento da lesão neurológica nos pacientes portadores da MAH/PET.
Palavras-chave: Fenótipo; Linfócitos T; Mielite; Infecções por HTLV-I; Vírus 1 linfotrópico T humano
Abstract
The Human T-lymphotropic virus 1 (HTLV 1) was the first retrovirus to be related to human disease. This virus infect T CD4+ cells and it is estimated that about 10-20 million people are infected worldwide, with about 1 to 5 % developing some HTLV-1-related illness. The most important HTLV-1 related diseases are Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), which is a nervous system inflammatory disease of the whose symptom is a progressive loss of motor capacity. The γδ T cells are T lymphocytes that have a γδTCR that, differently from αβ TCR expressed by αβ lymphocytes, is not restricted by MHC/peptide and may be activated by many antigens such as lipids and phosphoantigens. These cells may present cytotoxic and immunomodulatory activity, they are associated with an effective immune response to various pathogens. Many studies showed the participation of these cells in inflammatory disorders. Thereby, in this study, we analyzed the γδ lymphocytes from HTLV-1 patients peripheral blood to understand the development and progression of HAM/TSP. Our results demonstrated there are no alteration in the γδ lymphocytes percentual or γδ subpopulations in asymptomatic or HAM/TSP carriers. There are also no alterations in CD27 expression, molecule associated with immunological memory and cytokine production. However, we observed important alterations in protein associated with the cytotoxic function of these cells in HTLV-1 carriers. We identified a decrease in the granzime B expression but, surprisingly, we detected an increase in the expression of granzime B mRNA, suggesting higher granzime secretion. Moreover, we observed an increase in the expression of cytotoxicity associated receptors NKp30 e NKG2D. We also observed increased rates of IFN-producing in the γδ T in HTLV-1 carriers. Together, ours data demonstrate that HTLV-1 infection leads to phenotypic changes in the γδ lymphocytes population, despite no evidence of in vivo γδ infection, maybe suggesting that these cells are involved in the infection control or in the lesion development in HAM/TSP patients.
Keywords: T lymphocytes, HTLV-1
Mecanismos moleculares envolvidos na ativação do inflamossomo em resposta ao Aspergillus fumigatus.
Título
Título: Mecanismos moleculares envolvidos na ativação do inflamossomo em resposta ao Aspergillus fumigatus.
Aluno(a): Morena Scopel de Amorim Mendonça
Orientador(es): Prof. Rodrigo Tinoco Figueiredo
Resumo
Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso oportunista, sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes imunossuprimidos, acometidos com a aspergilose invasiva. O reconhecimento do fungo e a liberação de citocinas como a IL-1β e o TNF-α ocorrem através de receptores da imunidade inata, dentre eles a dectina-1 e o complexo inflamassomo NLRP3. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares envolvidos na ativação do inflamassomo durante a infecção ao A. fumigatus. Macrófagos peritoneais murinos elicitados foram estimulados com conídios de A. fumigatus e liberação de IL-1β e TNF-α foi avaliada por ELISA, enquanto a liberação da IL-1β e de Caspase-1 ativada no sobrenadante das células foi detectada por Western Blotting. A análise da viabilidade mitocondrial foi observada através de microscópio confocal. Observamos que macrófagos liberam IL-1β e TNF-α em resposta ao A. fumigatus, porém, quando dectina-1 e Syk são inibidos, a liberação de IL-1β não ocorre. NLRP3, ASC e caspase-1 são necessários para a liberação de IL-1β por macrófagos murinos estimulados com conídios de A. fumigatus. O efluxo de potássio e a perda de potencial de membrana mitocondrial são necessários para a liberação de IL-1β durante a infecção. Os resultados em conjunto indicam que a liberação de IL-1β em resposta ao A. fumigatus requer a via de sinalização dectina-1/Syk e ativação do inflamassomo NLRP3/ASC/caspase-1 através do efluxo de potássio e da perda do potencial de membrana mitocondrial.
Palavras-chave: Aspergillus fumigatus. Inflamassomo. IL-1β
Abstract
Aspergillus fumigatus is an opportunistic filamentous fungus, an important cause of morbidity and mortality among immunocompromised patients affected with invasive aspergillosis. The recognition of the fungus and the release of cytokines such as IL-1β and TNF-α occur through the innate immunity receptors, among them the dectin-1 and NLRP3 inflammasome complex. This study aimed to investigate the molecular mechanisms involved in activation of inflammasome during infection to A. fumigatus. Murine peritoneal elicited macrophages cells were stimulated with conidia of A. fumigatus and release of IL1β and TNF- α was assessed by ELISA, while the release of IL- 1β and caspase-1 activated in the cell supernatant was detected by Western blotting. The analysis of mitochondrial viability was observed by confocal microscopy. We observed that macrophages release IL1β and TNF-α in response to A. fumigatus. However when Dectin-1 and Syk are inhibited the release of IL-1β does not occur. NLRP3, ASC and caspase- 1 are required for the release of IL-1β stimulated macrophages with A. fumigatus conidia. The potassium efflux and loss of mitochondrial membrane potential are needed for IL- 1β release during infection. The results indicate that the release of IL- 1β in response to A. fumigatus requires signaling pathway of dectin-1/Syk and inflammasome NLRP3/ASC/caspase-1 activation through the efflux of potassium and loss of mitochondrial membrane potential.
Keywords: Aspergillus fumigatus. Inflammasome. IL-1β
Mecanismos de morte celular induzidos pelo vírus da dengue em células do endotélio microvascular cerebral humano
Título
Título: Mecanismos de morte celular induzidos pelo vírus da dengue em células do endotélio microvascular cerebral humano
Aluno(a): Michelle Premazzi Papa
Orientador(es): Prof. Luciana Barros de Arruda
Resumo
A dengue é uma doença viral transmitida pela picada de vetores como Aedes aegypti e Aedes albopictus e é considerada a mais importante arbovirose humana representando um importante problema de saúde pública de preocupação internacional. A infecção por qualquer um dos sorotipos de DENV pode causar tanto a forma clássica da doença como as formas mais graves conhecidas como síndrome de choque da dengue e febre hemorrágica da dengue. As formas mais graves caracterizam-se por hemorragia, trombocitopenia e extravasamento de plasma, que ocorrem devido às alterações de permeabilidade vascular e desregulação de hemostasia. Tanto ativação quanto a lesão de células endoteliais estão associados à perda da integridade do tecido, alteração da permeabilidade vascular e consequente extravasamento de plasma. Um dos mecanismos que podem influenciar na lesão endotelial na dengue é a morte celular. Entretanto os mecanismos de lesão ainda não são claros e, embora a morte celular por apoptose já tenha sido demonstrada em modelos in vitro, outros mecanismos nunca foram investigados assim como sua relação com a infecção viral. Em nosso estudo, utilizamos células do endotélio microvascular cerebral humano (HBMECs) e iniciamos uma análise da morte celular e seus mecanismos induzidos pelo DENV. HBMECs infectadas com DENV2 possuem uma diminuição da viabilidade celular após 72h de infecção, confirmado através do aumento de células marcadas com Anexina V e iodeto de propídio (PI), e da atividade da enzima LDH nos sobrenadantes das culturas. Foi observado que células infectadas apresentam aumento de atividade de caspase 3, sugerindo a indução de apoptose nas culturas. O tratamento dessas células com inibidores específicos de caspases 3, 9 e 8 reverteu parcialmente a liberação de LDH nos sobrenadantes, mas não a marcação com Anexina e PI. Avaliamos, então, a possibilidade de indução de necrose programada através do uso do inibidor de RIP-necrostatina (Nec-1). O tratamento de HBMECs com Nec-1 inibiu a morte celular induzida por DENV, sugerindo que esse mecanismo também pode estar acontecendo nas culturas de células infectadas. Para investigar se as células contendo ou não o antígeno viral sofrem mecanismos diferentes de morte celular, as mesmas foram separadas por cell sorting. Nós observamos que as células DENV- apresentam a maior proporção de células em processo de morte celular, caracterizado pela dupla marcação com Anexina V/PI e liberação de LDH. Esse fenótipo foi potencializado na presença do inibidor de pan caspases Z-VAD e inibido por tratamento com Nec-1, sugerindo a indução de necroptose em células não infectadas presentes nas culturas contendo DENV.
Palavras-chave: Dengue; Células Endoteliais; Morte Celular; Apoptose; Necrose programada
Abstract
Dengue is a viral disease transmitted through the bite of mosquitoes Aedes aegypti and Aedes albopictus and is considered the most important human arboviral disease representing an important public health problem of international concern. Infection with any of the DENV serotypes can cause both the dengue classical fever or dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome. The most severe forms are characterized by bleeding, thrombocytopenia and plasma leakage that occurs due to changes in vascular permeability and disruption of hemostasis. Both activation and endothelial cell injury are associated with loss of tissue integrity, alteration of vascular permeability and plasma leakage. One of the mechanisms that may affect endothelial injury is cell death; however, the mechanisms associated to tissue injury were not completely characterized. Apoptotic cell death has been demonstrated in in vitro models of endothelial cell infection, but other death mechanisms and their importance to virus replication have never been investigated before. In our study, we analyzed cell death and its mechanisms induced by DENV, using a human brain microvascular endothelial cell line (HBMECs) as a model. DENV2-infected HBMECs showed a decrease in cell viability after 72h of infection, associated to increased AnnexinV/propide iodide (PI) staining, and by the presence of LDH enzyme in the culture supernatants. DENV-infected cells presented an increased caspase 3 activity, suggesting the induction of apoptosis in the cultures. Treating these cells with inhibitors of caspase 3, caspase 8, and caspase 9 partially inhibited LDH, but not AnnexV/PI staining. We then evaluated whether programmed necrosis would be also triggered by the infection, by inhibiting RIP with necrostatin (Nec-1). Nec -1 treatment inhibited DENV-induced cell death, suggesting that necroptosis may also be stimulated in the cultures. To evaluate whether different mechanisms were induced in DENV-infected (DENV+) and bystander cells (DENV-), we separated each population by cell sorting. We observed that DENV- cells presented a higher proportion of cells with apoptotic/necroptic phenotype, in comparison to DENV+ cells. This was associated to higher LDH release and increased AnnexV/PI staining. This phenotype was potentiated by Z-VAD treatment and inhibited by necrostatin, suggesting that programmed necrosis was induced in the bystander cells presented in the DENV-infected cultures. We intend to investigate these hypotheses in detail and evaluate the effects of cell death on viral replication in our model.
Keywords: Dengue; Endothelial Cells; Cell Death; Apoptosis; Programmed Necrosis
Análise da resposta imunitária e da susceptibilidade à infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos deficientes em MyD88, IL-1R1 ou IL-18Ra..
Título
Título: Análise da resposta imunitária e da susceptibilidade à infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos deficientes em MyD88, IL-1R1 ou IL-18Ra..
Aluno(a): Joao Francisco Gomes Neto
Orientador(es): Profa. Maria Bellio
Resumo
Sabidamente, os camundongos Myd88-/- são altamente susceptíveis à infecção por T. cruzi. Além das vias TLR, a molécula MyD88 também está envolvida na sinalização de duas citocinas pro-inflamatórias: IL-1 e IL-1b. Assim, é possível que a deficiência em MyD88 torne os camundongos susceptíveis principalmente devido à ausência das sinalizações mediadas por IL-1R1 e IL-18Ra. No presente trabalho comparamos a susceptibilidade à infecção em camundongos de background B6 deficientes em MyD88 ou nos receptores IL-1R1 ou IL-18Ra, além de vários parâmetros da ativação da resposta imunitária inata e adquirida nestes animais. Avaliamos a parasitemia, sobrevivência, carga parasitária no coração e os níveis de células T CD4+ e CD8+ produtoras de IFN-Γ e GzmB, tanto no baço como no miocárdio. Também quantificamos a produção de IL-10, de TNF-a e de óxido nítrico (NO) por esplenócitos dos camundongos infectados e a expressão de mRNA para CCL5 no miocárdio. Finalmente, investigamos o dano e a função cardíaca nas diferentes linhagens através da atividade da isoenzima CK-MB e do exame de ECG. Os resultados demonstram que animais Il-1r1-/- e Il-18ra-/- apresentam uma susceptibilidade intermediária entre a observada para os camundongos Myd88-/- e os WT, morrendo em tempos precoces pós-infecção e apontam para um maior dano cardíaco dos camundongos MyD88, IL-1R1 e IL-18Ra, em relação aos WT. Sendo assim, o presente trabalho demonstra a importância das vias de sinalização mediadas por IL-1R1 e IL-18Ra na resistência contra a infecção pelo T.cruzi.
Palavras-chave: Trypanossoma cruzi, Linfócitos T, MyD88, IL-1R1, IL-18Ra.;
Abstract
It is known that Myd88-/- mice are highly susceptible to infection with T. cruzi. In addition to the TLR pathways, the MyD88 molecule is also involved in the signaling cascade induced by two pro-inflammatory cytokines: IL-1b and IL-18. Thus, it is possible that MyD88 deficiency renders mice susceptible mainly due to the absence of signals mediated by IL-1R1 and IL-18Ra. In the present work we compare the susceptibility to infection in mice of the B6-background, either deficient in MyD88 or in the IL-1R1 or IL-18Ra receptors. In addition, different parameters of the innate and acquired immune responses were evaluated in these animals. We analyzed the parasitemia, survival, parasite load in the heart and the levels of CD4+ and CD8+ T cells producing IFN- and GzmB, both in the spleen as in the myocardium. We also quantified the production of IL-10, TNF-a, and nitric oxide (NO) production by splenocytes from infected mice, as well as IL-10, CD8a and CCL5 mRNA expression in the myocardium. Finally, we investigated the cardiac damage and function in the different strains of mice by isoenzyme CK-MB activity in the serum and ECG. The results demonstrate that Il-1r1-/- and Il-18ra-/- mice exhibit an intermediate susceptibility between the one observed in Myd88-/- and WT mice, dying at early time points post-infection. Moreover, Myd88-/-, Il-1r1-/- and Il-18ra-/- mice display more severe heart damage in comparison to WT mice. Therefore, this work demonstrates the importance of the signaling pathways mediated by IL-1R1 and IL-18Ra in resistance against infection with T. cruzi.
Keywords: Trypanosoma cruzi , T lymphocytes, MyD88, IL-1R1, IL-18Ra.
Infecção de fagócitos derivados de células B-1 (B-1CDP) por Leishmania major.
Título
Título: Infecção de fagócitos derivados de células B-1 (B-1CDP) por Leishmania major.
Aluno(a): Angelica Fernandes Arcanjo Sampaio
Orientador(es): Prof. Celio Geraldo Freire de Lima
Resumo
As células B-1 são uma pequena fração da população de linfócitos B do baço, e estão presentes como população majoritária de linfócitos B nas cavidades pleural e peritonial. Alguns autores têm demonstrado que as células B-1 secretam IL-10 e são capazes de modular a atividade fagocítica de macrófagos, suprimindo desta maneira o sistema imunitário. Além da capacidade de modulação da atividade fagocítica, outros estudos demonstraram que em camundongos e humanos, as células B-1 podem gerar descendentes fagocíticos, exibindo características similares aos macrófagos. Essas células foram posteriormente denominadas de B-1CDP (fagócitos derivados de célula B-1). Essas evidências nos motivaram a estudar a ação desses fagócitos derivados de células B-1 na infecção experimental por patógenos intracelulares e em processos inflamatórios. Para esse propósito utilizamos o modelo experimental de infecção com Leishimania major. Nossos dados demonstraram que as células B-1CDP são mais susceptíveis a infecção por L. major in vitro e esse efeito pôde ser bloqueado quando adicionamos doses neutralizantes do anticorpo anti-IL-10, o mesmo efeito não foi observado quando adicionamos doses neutralizantes do anticorpo anti-TGF-. Também observamos a presença de um grande número de corpúsculos lipídicos nas células B-1CDP e consequentemente um aumento na produção do mediador lipídico PGE2. As células B-1CDP tem sua produção de IL-10 inibida quando ocorre a inibição da enzima COX-2. Caracterizando assim, que a produção da citocina IL-10 foi significativamente dependente da produção de PGE2. Esses dados fortemente sugerem que as células B-1CDP são componentes celulares que podem comprometer a resposta imune do hospedeiro durante doenças infecciosas.
Palavras-chave: Leishmania major, células B-1, fagócitos, infecção, citocinas e PGE2
Abstract
B-1 cells are a small fraction of the population of B lymphocytes of the spleen and they represent the major population of B lymphocytes in the pleural and peritoneal cavity. It has been demonstrated that B-1 cells secrete IL-10 and thereby they modulate the phagocytic activity of macrophages, as well as suppress the immune system. This information is based on studies showing that, in mice and human, B-1 cells can generate offspring phagocyte, exhibiting similar characteristics of macrophages. The B-1 cells in primary cultures proliferate and become a mononuclear phagocyte. These cells were called B-1 cell-derived mononuclear phagocyte (B-1CDP). This evidence motivated us to study the actions of B-1CDP cells in infectious and inflammatory processes. For this propose we used the model of experimental infection with Leishmania major. Our data demonstrated that B1CDP are more susceptible to infection by L. major in vitro and this effect is blocked by the pretreatment with neutralizing anti-IL-10 but not anti-TGF-. Also, we observed the presence of a large number of lipid bodies in B-1CDP and PGE2 production. B-1CDP cells are defective in IL-10 production in response to COX-2 inhibitors. The IL-10 production was shown to be significantly dependent on the PGE2 production. These data strongly suggest that B-1CDP cells are cellular components that might compromise host immune responses to infection diseases.
Keywords: Leishmania major, B- 1 cells, Phagocytes, Infection, Cytokines, PGE2;
Caracterização estrutural e dinâmica do domínio RRM1 do antígeno R humano (HuR), uma proteína central no controle pós-transcricional da resposta inflamatória.
Título
Título: Caracterização estrutural e dinâmica do domínio RRM1 do antígeno R humano (HuR), uma proteína central no controle pós-transcricional da resposta inflamatória.
Aluno(a): Amanda Alves de Almeida Mujo
Orientador(es): Prof. Anderson de Sá Pinheiro
Resumo
O antígeno R humano (HuR) é uma proteína ubíqua capaz de interferir no destino de tradução de várias proteínas através do reconhecimento de AREs em mRNA. Essa proteína exerce um papel central na resposta inflamatória, pois é capaz de silenciar ou suprimir mRNA’s de importantes componentes do sistema imunológico. A afinidade de ligação da HuR com seus alvos está fundamentada não somente na sua estrutura molecular, mas também na dinâmica em que o estado conformacional de maior afinidade ao ligante é selecionado. A HuR é composta por três domínios funcionais conhecidos como RRM1, RRM2 e RRM3. O domínio RRM1 é o principal responsável pela afinidade de ligação da HuR aos seus alvos de mRNA. No presente estudo, a dinâmica interna do domínio RRM1 isolado (RRM11-99) foi estudada por RMN, com o intuito de estabelecer um paralelo entre estrutura, dinâmica e função para esta proteína. Os espectros de RMN foram coletados em um espectrômetro Bruker 800 MHz utilizando uma amostra purificada do domínio RRM11-99 marcada isotopicamente com 15N e/ou 15N/13C. O assinalamento das ressonâncias do domínio RRM11-99 foi realizado com o programa CARA. A dinâmica da cadeia principal foi derivada das medidas de relaxação do núcleo de 15N, incluindo R1, R2 e {1H}-15N NOE. Os resultados dosestudos de dinâmica revelaram que a função de reconhecimento dos vários alvos daHuR pode estar associada à sua plasticidade estrutural. Dentro deste contexto, otrabalho propõe que a alça L3 do domínio RRM1-99, altamente flexível, pode representar um possível sítio de interação a diferentes moléculas de RNA. Além disso, a presença de resíduos em troca conformacional no sítio primário de ligação ao mRNA (fitas 1 e 3) sugere fortemente que o reconhecimento dos substratos possa ser resultado de XIIuma seleção conformacional, o que infere um certo questionamento à teoria de ajuste induzido proposta anteriormente
Palavras-chave: ZIKV; linfócitos T CD4+; anticorpos; interferon γ; inflamação
Abstract
Human antigen R (HuR) is a ubiquitous protein that recognizes AREs in mRNA, thereby interfering with the fate of protein translation. This protein plays a central role on the outcome of the inflammatory response as it may stabilize or silence the mRNAs of key components of the immune system. HuR is able to interact with other RBPs, reflecting a complex network that dictates mRNAs post-transcriptional control. HuR is composed of three functional domains, known as RRM1, RRM2 and RRM3. It is known that RRM1 is the most important domain for mRNA binding affinity. In this study, we evaluated the dynamics of HuR’s RRM1 isolated domain by NMR, as to establish a structure, dynamics and function relationship for this protein. The NMR spectra were collected on a 15N- and/or a 15N/13C-labeled purified RRM1 sample using a Bruker 800 MHz spectrometer. Sequence-specific resonance assignment was performed using the program CARA. Backbone dynamics were derived from 15N-relaxation measurements including R1, R2 and { 1H}- 15N NOE. The results from dynamics studies revealed that structural plasticity may be underlying the promiscuous mRNA recognition pattern of HuR. Here, we propose that the RRM1 highly flexible L3 loop may represent a potential site for interaction with different mRNA molecules. Furthermore, the presence of residues undergoing conformational exchange at the mRNA’s primary binding site (1 and 3-sheets) strongly suggests that RNA’s substrate recognition may be related to the phenomenon of conformational selection, which challenges the induced fit theory previously reported
Keywords: ZIKV; linfócitos T CD4+; anticorpos; interferon γ; inflamação
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