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DISSERTAÇÕES
Avaliação da função mitocondrial em células de glioblastoma multiforme com ácido pomólico.
Título
Título: Avaliação da função mitocondrial em células de glioblastoma multiforme com ácido pomólico.
Aluno(a): Tamires da Silva Santos
Orientador(es): Prof. Celio Geraldo Freire de Lima
Resumo
Glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor cerebral primário mais grave e representa 50% de todos os gliomas. O tratamento consiste na ressecção cirúrgica, seguido de rádio e/ou quimioterapia. Em pacientes com GBM, o resultado dessas abordagens terapêuticas tem sido falha e o tempo médio de sobrevivência permanece menos do que um ano a partir do momento do diagnóstico. Trabalhos realizados pelo nosso grupo mostraram que o triterpeno ácido pomólico (AP) é citotóxico para linhagens de GBM, e que essa atividade é mediada pela via mitocondrial. Porém a atividade desse composto sobre a função mitocondrial ainda não foi investigada. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do AP sobre a função mitocondrial de células de GBM. Foi utilizada a linhagem A172 de GBM humano. O ensaio de MTT mostrou que o AP inibe a viabilidade celular da linhagem. Ensaios utilizando citometria de fluxo mostraram que o AP induziu a fragmentação de DNA, o desacoplamento mitocondrial e a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O efeito do AP na morte celular e produção de ROS foram inibidos pelo tratamento com o NAC. Esses resultados indicam o envolvimento da via mitocondrial e a participação de ROS na indução de morte celular por esse composto. Ensaios com mitocôndrias isoladas utilizando oxígrafo de alta resolução e fluorímetro mostraram que o AP inibe o consumo de oxigênio dos complexos I e IV e aumenta a produção de ROS mitocondrial, respectivamente. O AP também inibiu a produção de ATP determinada por luminescência. Em conjunto, os dados obtidos indicam que o AP altera a função mitocondrial durante a morte celular induzida por este composto e corrobora para sua possível utilização no desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento de GBM.
Palavras-chave: Glioblastoma; Ácido pomólico; mitocôndria
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most severe primary brain tumor and accounts for 50% of all gliomas. Treatment consists of surgical resection, followed by radio and / or chemotherapy. In patients with GBM, the result of these therapeutic approaches has been failure and survival average time remains less than one year from the time of diagnosis. Work carried out by our group showed that the triterpene pomolic acid (PA) is cytotoxic to strains of GBM, and that this activity is mediated by mitochondrial pathway. But the activity of this compound on mitochondrial function has not been investigated. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of AP on mitochondrial function of GBM cells. The A172 strain of human GBM was used. Using the MTT assay it was shown that AP inhibited the cell viability. Assays using flow cytometry showed that AP induced DNA fragmentation, mitochondrial uncoupling and the production of reactive oxygen species (ROS). The effect of PA in cell death and ROS production were inhibited by the treatment with NAC. These results suggest the involvement of the mitochondrial pathway and the involvement of ROS in cell death induction by this compound. Tests on isolated mitochondria using high resolution oxygraph and fluorimeter showed that PA inhibits oxygen consumption in complexes I and IV and increases mitochondrial ROS production, respectively. Luminescence assays showed that AP also inhibits the production of ATP. Together, these data indicate that the PA changes the mitochondrial function during cell death induced by this compound and its possible supports for use in the development of new approaches for treatment of GBM.
Keywords: Glioblastoma; Pomolic acid; mitochondria.
Caracterização da expressão e dos mecanismos de secreção da IL-1β em eosinófilos humanos.
Título
Título: Caracterização da expressão e dos mecanismos de secreção da IL-1β em eosinófilos humanos.
Aluno(a): Renata Baptista dos Reis
Orientador(es): Profa. Josiane Sabbadini Neves
Resumo
Eosinófilos contém uma variedade de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento pré-formados em seus grânulos cristaloides citoplasmáticos. Embora muitos trabalhos demonstrem a habilidade dos eosinófilos de pré-estocar e secretar seletivamente citocinas em resposta a estímulos específicos, pouco se sabe à respeito dos mecanismos envolvidos na síntese e secreção de IL-1β. Recentemente foi demonstrado que eosinófilos humanos isolados são capazes de secretar IL-1β, entre outras citocinas, em resposta a diferentes estímulos. Contudo a via de sinalização envolvendo essa secreção não é conhecida. Além disso, não existem evidências diretas na literatura de que eosinófilos humanos pré-estoquem IL-1β, na sua forma precursora ou madura, quer seja nos seus grânulos cristaloides ou em outros compartimentos celulares. Desta forma a proposta do presente trabalho é de investigar a expressão da IL-1β, bem como a via de sinalização que culmina com a secreção desta citocina em eosinófilos humanos. Utilizando citometria de fluxo e microcopia confocal de fluorescência verificamos que eosinófilos humanos são capazes de expressar constitutivamente a citocina IL-1β, assim como proteínas envolvidas na montagem do complexo inflamassoma, NLRP3 e ASC. Demonstramos ainda que eosinófilos humanos secretam a IL-1β para o meio extracelular quando estimulados com GM-CSF (50 ng/mL) de maneira caspase-1 dependente. Ainda segundo nossos achados, a secreção de IL-1β por eosinófilos parece envolver a participação de NLRP3 e ROS. Nossos resultados também demonstraram que a IL-1β secretada por eosinófilos humanos em resposta ao GM-CSF atua de forma autócrina levando à secreção de proteínas catiônicas (possivelmente ECP e EDN). Estes achados podem contribuir de maneira impactante para a identificação de novas vias de sinalização passíveis de modulação para o controle de desordens eosinofílicas.
Palavras-chave: Eosinófilos. Inflamassoma. IL-1β
Abstract
Eosinophils contain a wide range of preformed cytokines, chemokines and growth factors in their cytoplasmic crystalloid granules. Although many studies have demonstrated the eosinophil ability of pre-storing and selectively secreting cytokines in response to specific stimuli, it is largely unknown how are the mechanisms involved in the synthesis and secretion of IL-1β. Recently it has been shown that isolated human eosinophils are able to secrete IL-1β, among other cytokines in response to different stimuli. However, the signaling pathway involving in this secretion is not known. Furthermore, there is no direct evidence in the literature that human eosinophils can store IL-1β in their mature or precursor form, either in its crystalloid granules or other cellular compartments. Thus, the aim of this study is to investigate the expression of IL-1β and the signaling pathway that culminates in the secretion of this cytokine in human eosinophils. Using flow cytometry and confocal fluorescence microscopy we have found that human eosinophils are capable of constitutively expressing the cytokine IL-1β, as well as proteins involved in assembling the inflammasome complex, NLRP3 and ASC. We also demonstrated that human eosinophils secrete IL-1β into the extracellular medium when stimulated with GM-CSF (50 ng/mL) of caspase-1 dependent manner. Also according to our findings, the secretion of IL- 1β by eosinophils appears to involve the participation of NLRP3 and ROS. Our results also demonstrated that IL-1β is secreted by human eosinophils in response to GM-CSF acts in an autocrine way leading to the secretion of cationic proteins (possibly ECP and EDN). These findings may contribute in a relevant manner to identify new signaling pathways susceptible to modulation to control eosinophilic disorders.
Keywords: Eosinophils. Inflammasome. IL-1β.
Estudo da imunodeficieênc8ia ligada ao X no curso da infecção experimental pelo Cryptococcus gattii
Título
Título: Estudo da imunodeficieênc8ia ligada ao X no curso da infecção experimental pelo Cryptococcus gattii
Aluno(a): Pablo Rodrigo da Rosa
Orientador(es): Prof. Celio Geraldo Freire de Lima
Resumo
Um milhão de casos de criptococose meningoencefálica ocorrem por ano. Enquanto Cryptococcus neoformans acomete indivíduos imunocomprometidos, Cryptococcus gattii tem a capacidade de infectar imunocompetentes, sendo as duas principais espécies causadoras dessa infecção fúngica. A cápsula de C. gattii é o seu maior fator de virulência e o principal polissacarídeo capsular é glucuronoxilomanana (GXM). Estudos recentes de anticorpos séricos reativos contra o polissacarídeo capsular GXM relatam uma contribuição importante de anticorpos pré-existentes produzidos naturalmente por células B-1. O modelo de camundongo com imunodeficiência ligada ao X (XID), possui uma mutação no gene que codifica a tirosina quinase de Bruton (Btk), conduzindo a um bloqueio no desenvolvimento de células B, predominantemente células B-1. Estas células residem principalmente nas cavidades peritoneal e pleural secretando IgM e IgG2 em resposta a antígenos independentes do tipo 2 (TI-2), tal como é o componente capsular GXM de C. gattii. Objetivos: Estudar o papel da célula B-1 na infecção experimental por C. gattii. Métodos: Camundongos XID e BALB/c foram infectados por via intratraqueal com C. gattii. A sobrevivência dos animais, variação de peso, carga fúngica, nível de anticorpos anti-GXM, tamanho capsular, citocinas, recrutamento de leucócitos, atividade fagocítica e vacuolização de macrófagos foi avaliada nos dias 0, 7 e 19 do curso infeccioso. Resultados: Nosso modelo de infecção pulmonar crônica revelou que os camundongos com a mutação em Btk, em comparação com animais normais, tiveram mortalidade antecipada, perda de peso significativa, redução no título de IgM e IgG soro-específica para GXM, aumento da carga fúngica cerebral, maior carga fúngica na corrente sanguínea, redução do número de células totais no lavado broncoalveolar, com diminuição de fagócitos e aumento de eosinófilos, concernente ao seu perfil anti-inflamatório de citocinas presentes no BAL. Também houve aumento capsular de C. gattii, fagocitose prejudicada na ausência de opsoninas antígeno-específicas in vitro, baixa taxa de vacuolização dos macrófagos alveolares in vivo e uma incapacidade de conter C. gattii nos pulmões. Conclusão: Nossos resultados mostram que camundongos XID têm maior susceptibilidade à infecção por C. gattii sugerindo que ocorre uma correlação entre a presença de anticorpos anti-GXM e a proteção contra a infecção
Palavras-chave: Célula B-1, Cryptococcus gattii, XID, Btk
Abstract
One million cases of meningoencephalitis cryptococcosis occur per year. While Cryptococcus neoformans affects immunocompromised individuals, Cryptococcus gattii has the ability to infect immunocompetent, therefore they are considered as the main species that cause this fungal infection. The capsule of C. gattii is the greatest virulence factor and the main capsular polysaccharide of it is the glucuronoxylomannan (GXM). Recent studies reported reactive serum antibodies against the capsular polysaccharide GXM, with an important contribution of preexisting natural antibodies produced by B-1 cells. The X-linked immunodeficiency (XID) mouse model, which has a mutation in the gene that encodes Bruton’s tyrosine kinase (BTK), leading to a blocking in B-cell development, predominantly B-1 cells. These cells primarily reside in the peritoneal and pleural cavities, secreting IgM and IgG2 in response to type thymus-independent antigens 2 (TI-2), such as the capsular componente GXM of C. gattii. Objectives: Studing the role of B-1 cell in the experimental infection of Cryptococcus gattii. Methods: XID mice and BALB/c mice were intratracheally infected with C. gattii. The survival of the animals, weight variation, fungal load, level of anti-GXM antibodies, capsule size, cytokines, recruitment of leukocyte, phagocytic activity of macrophages and vacuolization was assessed on the days 0, 7 and 19 of the infectious course. Results: Our model of chronic pulmonary infection revealed that mice with mutations in Btk, compared with normal animals, had early mortality, significant weight loss, low titer of IgM and IgGspecific for GXM, increased brain fungal burden, higher fungal burden in blood stream, reduced in the number of total cells in BAL fluid, with a decrease of phagocytes and an increase of eosinophils, concerning its anti-inflammatory profile of cytokines which present in the BAL fluid. Also there was an increase in capsular C. gattii, an impaired of phagocytosis in the absence of antigen-specific opsonin in vitro, low rate of vacuolation of alveolar macrophages in vivo and the inability to contain C. gattii in lungs. Conclusion: Our results show that XID mice have increased susceptibility to infection by C. gattii suggesting a correlation between the presence of anti-GXM antibodies and protection against infection.
Keywords: B-1 cell, Cryptococcus gattii, XID, Btk
Função da 5-LIPOXIGENASE na leishmaniose visceral.
Título
Título: Estudo da imunodeficieênc8ia ligada ao X no curso da infecção experimental pelo Cryptococcus gattii
Aluno(a): Pablo Rodrigo da Rosa
Orientador(es): Prof. Celio Geraldo Freire de Lima
Resumo
O parasito tripanosomatídeo Leishmania (L.) infantum chagasi é um importante agente causador da leishmaniose visceral e tem como característica a visceralização do parasitismo dado a sua intensa colonização do sistema monofagocítico nuclear. O parasita infecta especificamente macrófagos que, apesar de serem importantes componentes das respostas protetoras devido à intensa fagocitose e a indução de estresse oxidativo capaz de produzir intermediários oxido- e nitro-reativos, consistem no principal reservatório deste patógeno. As respostas efetoras na ativação de macrófagos são críticas no desenvolvimento de proteção à infecção visceral, sendo determinadas pelas respostas inatas e adaptativas do sistema imunológico. Nos modelos propostos para o estudo da infecção pela Leishmania (L.) infantum chagasi, a indução de respostas inflamatórias é essencial para a ativação do do sistema monofagocítico nuclear e a contenção do crescimento parasitário. Neste contexto, diversos estudos ressaltam a função da 5-lipoxigenase, uma enzima chave na via das lipoxigenases, na formação de leucotrienos, importantes mediadores lipídicos inflamatórios críticos na resolução de infecções parasitárias. O presente trabalho visa estudar a participação da enzima 5-lipoxigenase na infecção pelo parasita Leishmania (L.) infantum chagasi. Em nosso estudo utilizamos animais 5-LO-/- e controles selvagens para investigar a importância da via lipoxigenase na indução de respostas protetoras na leishmaniose visceral. Nossos resultados indicam que animais 5-LO-/- são mais suscetíveis ao estabelecimento da doença, apresentando uma resposta imune celular deficiente, com baixo níveis de produção de respostas linfocitárias IFN-y-dependentes, associadas ao controle do parasitismo. Experimentos de reconstituição dos animais deficientes com a população de células T indicam uma função determinante da via 5-lipoxigenase no estabelecimento de respostas adaptativas dependentes de células TCD4+ produtoras de IFN-g. Esses dados apontam para uma função determinante da 5-lipoxigenase na indução de respostas T celulares protetoras contra a infecção pela Leishmania (L.) infantum chagasi
Palavras-chave: Leishmania (L.) infantum chagasi; 5-LIPOXIGENASE; LEISHMANIOSE VISCERAL
Abstract
The tripanosomatid parasite Leishmania (L.) infantum is an important causative agent of visceral leishmaniasis and is characterized by the visceralization of parasitism given its intense colonization of mononuclear phagocyte system. The parasite infect macrophages specifically, despite beying a major component component of protective response due to intense phagocytosis and induction of oxidative stress capable of production of intermediates oxid- and nitro-reactives, consists on the main reservatory of this pathogen. The effective responses in macrophage activation are critical in the development of protection for visceral infection, determined by the innate and adaptive responses of the immunological system. In the proposed models for the study of infection by Leishmania (L.) infantum chagasi, induction of inflammatory response are essencial for the activation of mononuclear phagocyte system and the containment of parasite growth. In this context, several studieshave emphasized the role of 5-lipoxygenase, a key enzyme in the lipoxygenase pathway, in the formation of leukotrienes, important lipid inflammatory madiators, critical in the resoluction of parasitic infections. This works aim to study the role of the enzyme 5-lipoxygenase in the infection by the parasite Leishmania (L.) infantum chagasi. In our study we used 5-LO-/- animals e wild-type controls to investigate the importance of the lipoxygenase pathway in the induction of protective responses in visceral leishmaniasis. Our results indicate the animals 5-LO- /- are more susceptible to the establishment of the disease, presenting a defective cellular immune response, with low levels of production of lymphocyte responses IFN-y dependent, associated with the parasitism control. Reconstitution experiments of knockout animals with the population of T cells indicate a decisive role of the 5- lipoxygenase pathway in the establishment of adaptive responses of T CD4+ cells IFN-y producers. These data point to a crucial role of 5-lipoxygenase in the induction of T cells protective responses against infection by Leishmania (L.) infantum chagasi.
Keywords: Glioblastoma; Pomolic acid; mitochondria.
Papel da prostaglandina D2 endógena murina na infecção por Schistosoma mansoni
Título
Título: Papel da prostaglandina D2 endógena murina na infecção por Schistosoma mansoni
Aluno(a): Isaac Belas Cunha dos Santos
Orientador(es): Profa. Christianne Bandeira de Melo
Resumo
A prostaglandina D2 (PGD2) é um mediador lipídico produzido principalmente por mastócitos na asma alérgica crônica e outras doenças inflamatórias. Recentemente, demonstrou-se que os eosinófilos também são células produtoras de PGD2, que por sua vez é reconhecido como um estímulo potente de ativação de eosinófilos. Durante a infecção por Schistosoma mansoni, PGD2 derivada de Schistosoma aparece como um regulador chave na evasão do parasita da defesa imunológica, controlando a resposta imune cutânea através da inibição da migração das células de Langherhans. No entanto, o papel da PGD2 do hospedeiro durante a infecção por S. mansoni não está estabelecido. Neste trabalho, investigamos o papel de PGD2 produzida pelo hospedeiro durante a progressão da infecção por S. mansoni experimental. Camundongos C57Bl/6 foram infectados por penetração transcutânea com 60-70 cercárias de S. mansoni (cepas BH, Instituto Oswaldo Cruz, RJ, Brasil). No dia 24 de infecção, as bombas osmóticas (Alzet® bomba; 100 µl) contendo HQL-79 (liberando: 24 µg/dia), um inibidor específico da PGD sintase hematopoiética (HPGDS), foram implantadas subcutaneamente em camundongos infectados e não infectados. As bombas permaneceram durante 4 semanas, quando os animais foram sacrificados. Os parâmetros de infecção e eosinofilia, a produção de mediadores lipídicos e a fibrose foram analisados na medula óssea, sangue, lavado peritoneal e no fígado. Constatamos que níveis aumentados de PGD2 são encontrados no fígado e cavidade peritoneal de camundongos infectados por S. mansoni e que essa produção sistêmica de PGD2 foi afetada pelo tratamento com HQL-79. HQL-79 diminuiu o número de eosinófilos no sangue periférico, lavado peritoneal e nos granulomas hepáticos de camundongos infectados com S. mansoni, enquanto vii nenhuma alteração foi observada sobre na quantidade de eosinófilos na medula, indicando que a inibição da síntese de PGD2 afeta apenas a eosinofilia periférica. O tamanho dos granulomas hepáticos não foi modificado por HQL-79, porém a inibição da síntese de PGD2 reduziu o número de granulomas esquistossomóticos no fígado em comparação com camundongos não tratados. Além disso, o tratamento com HQL-79 diminuiu a síntese de leucotrieno C4 hepático, indicando que a PGD2 endógena relacionada à infecção induz a atividade da lipoxigenase durante a infecção. Os resultados indicam que a PGD2 endógena derivada de células hematopoiéticas é um mediador lipídico chave na esquistossomose, controlando a formação de granulomas e instalação da inflamação
Palavras-chave: PGD2, Eosinófilos, Granuloma hepático, Schistosoma mansoni
Abstract
Prostaglandin D2 (PGD2) is a lipid mediator mainly produced by mast cells in chronic allergic asthma and other inflammatory disorders. Recently, it has been demonstrated that eosinophils are also cell sources of PGD2, which in turn is recognized as a potent stimulus of eosinophil activation. During S. mansoni infection, schistosoma-derived PGD2 has emerged as a key parasite regulator of immune defense evasion, controlling cutaneous immune responses through inhibition of Langherhans cell migration. However, the role of host PGD2 during S. mansoni infection is not established. In this work, we investigated the role of host-derived PGD2 during the progression of experimental S. mansoni infection. C57Bl/6 mice were infected by transcutaneous penetration of 60-70 cercariae of Schistosoma mansoni (BH strain, Institute Oswaldo Cruz, RJ, Brazil). At the 24th day post infection, osmotic pumps (Alzet® pump; 100µl) containing HQL-79 (deliver rate: 24 µg/day), a specific inhibitor of hematopoeitic PGD synthase (H-PGDS), were implanted subcutaneously in infected and non-infected micewhich stayed for 4 weeks, when animals were sacrificed. Infection parameters, eosinophilia, lipid mediator production and fibrosis were analyzed in the bone marrow, blood, peritoneal fluid, and liver. We observed that increased levels of PGD2 are found in the liver and peritoneal cavity of S. mansoni-infected mice and that such systemic production of PGD2 was impaired by HQL-79 treatment. HQL-79 decreased eosinophilia in peripheral blood and eosinophil numbers found in peritoneal fluid and liver granulomas of S. mansoni-infected mice, while no alteration was observed in bone marrow eosinophil numbers, indicating that inhibition of PGD2 synthesis affects only peripheral eosinophilia. Whereas the size of hepatic granulomas was not modified by ix HQL-79, inhibition of PGD2 synthesis reduced the number of schistossomal granulomas in the liver compared to non-treated mice. Moreover, HQL-79 treatment decreased hepatic amounts of leukotriene C4, indicating that infection-related endogenous PGD2 induces lipoxygenase activity during infection. Our results indicate that hematopoeitic cells-derived endogenous PGD2 is a key lipid mediator of schistosomiasis, controlling granuloma formation and installation of systemic increase in eosinophil population during infection
Keywords: PGD2, Eosinophils, Hepatic granuloma, Schistosoma mansoni
Redes de DNA extracelular de neutrófilos (NETs) Induzidas por laminina e fibronectina isoladamente e em associação com promastigotas de Leishmania amazonensis
Título
Título: Redes de DNA extracelular de neutrófilos (NETs) Induzidas por laminina e fibronectina isoladamente e em associação com promastigotas de Leishmania amazonensis
Aluno(a): Gustavo da Silva Oliveira
Orientador(es): Profa. Elvira Maria Saraiva Chequer Bou Habib
Resumo
Neutrófilos após vários estímulos tais como Leishmania amazonensis (La), liberam redes extracelulares de neutrófilos (NETS), que são formadas pela cromatina descondensada associada a proteínas citosólicas e granulares. Promastigotas de La são inoculadas pelo inseto vetor numa poça de sangue, onde entram em contato com os neutrófilos e proteínas da matriz extracelular (ECM). Aqui, nós estudamos a interação de neutrófilos com fibronectina e isoformas de laminina, isoladamente ou em associação com La. Analisamos a expressão da integrina α6, um importante receptor de laminina (CD49f), e os nossos resultados mostraram que cerca de 70% dos neutrófilos expressam esse receptor. A seguir avaliamos se neutrófilos estimulados com as diferentes isoformas de laminina (111, 211, 332, 411, 421 e 511) e fibronectina seriam capazes de induzir a liberação de NETs. Os nossos resultados mostram que todas as isoformas de laminina e fibronectina foram capazes de induzir a liberação das NETs de forma dose dependente. No entanto nenhuma das isoformas ou a fibronectina foram capazes de modular a NETose induzida por promastigotas de La. Interessamo-nos também em avaliar possíveis diferenças entre as NETs induzidas por neutrófilos aderidos a uma superfície revestida por laminina ou fibronectina ou em suspensão. Nossos resultados demonstraram que tanto neutrófilos estimulados pelas isoformas de laminina ou por fibronectina, adsorvidas ou em suspensão, foram capazes de liberar NETs. O mecanismo de liberação de NETs é dependente de espécies reativas de oxigênio (ERO), e avaliando este aspecto, detectamos diferenças na ativação dessa via de sinalização entre as isoformas 411 e 511. Nossos resultados sugerem que a produção de ERO esta envolvida na NETose induzida pela isoforma 511, mas não na isoforma 411. A elastase neutrofílica, enzima que participa do processo de descondensação da cromatina, participa da NETose induzida pelas isoformas 411 e 511. Evidenciamos ainda que as cadeias α1, α4 e α5 de laminina colocalizam com as NETs induzidas pelos neutrófilos estimulados com PMA ou La. Juntos, os nossos dados mostram que laminina e fibronectina induzem a liberação de NETs. A NETose induzida pelas isoformas 411 e 511 parece envolver vias de sinalização diferentes. Demonstramos ainda que cadeias α1, α4 e α5 de laminina estão associadas às NETs induzidas por La e PMA.
Palavras-chave: eutrófilos, redes extracelulares de neutrófilos, matriz extracelular, laminina, fibronectina, Leishmania amazonensis.
Abstract
Neutrophils upon various stimuli such as Leishmania amazonensis (La), release neutrophil extracellular traps (NETs), scaffolds of decondensed chromatin associated with granular and cytosolic proteins. Leishmania promastigotes (La) are inoculated by the insect vector in a pool of blood, in close contact with neutrophils and proteins of the extracellular matrix (ECM). Here, we studied the interaction of neutrophils with fibronectin and laminin isoforms, alone or in combination with La. Firstly, we analyzed the expression of α6 integrin, a major laminin receptor (CD49f), and our results showed that about 70% of neutrophils express this receptor. Next we evaluate if neutrophils stimulated with laminin isoforms (111, 211, 332, 411, 421 and 511) and fibronectin would be capable of inducing the release of NETs. Our results show that all isoforms of laminin and fibronectin were able to induce the release of NETs in a dose dependent manner. However none of the laminin isoforms or fibronectin were able to modulate NETose induced by La promastigotes. We also evaluate possible differences between NETs induction by neutrophils adhered to a surface coated with laminin or fibronectin or in suspension. Our results showed that neutrophils stimulated by the isoforms of laminin or by fibronectin adsorbed or in suspension, were able to release NETs. NET release mechanism is dependent on reactive oxygen species (ROS), and evaluating this aspect, we detect differences in the activation of this signaling pathway between the laminin isoforms 411 and 511. Our results suggest that the production of ROS is involved in NETose induced by the 511 isoform, but not by the 411 isoform. Neutrophil elastase, an enzyme that participates in the chromatin decondensation process, is involved in the NETose induction by both 411 and 511 isoforms. Interestingly, we evidenced that the α1, α4 and α5 laminin chains colocalize with NETs induced by PMA or LA. Together, our data show that laminin and fibronectin induces the release of NETs. NETose induction by the isoforms 411 and 511 seems to involve different ROS signaling pathways. We also demonstrated that α1, α4 and α5 of laminin chains are associated with NETs induced by La and PMA.
Keywords: neutrophil, neutrophil extracellular traps, extracellular matrix, laminin, fibronectin, Leishmania amazonensis.
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