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DISSERTAÇÕES

Título

Título: Papel da mioglobina na resposta imune inata no modelo de rabdomiolise em camundongos.

Aluno(a): Andreza Moreira dos Santos Gama

Orientador(es): Prof(a). Marcelo Torres Bozza

Resumo

A mioglobina é uma proteína ligadora de oxigênio presente em células musculares. Contém uma única cadeia polipeptídica de 153 aminoácidos de sequência conhecida e um único grupo ferro-porfirina ou heme. Esta proteína é a principal nefrotoxina associada ao dano na rabdomiólise. Os mecanismos propostos para sua toxicidade incluem obstrução tubular, injúria oxidativa, vasoconstrição, apoptose e inflamação. A mioglobina induz a expressão de moléculas de adesão, de fatores de transcrição como AP-1 e NFκB e de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-1β. Outro efeito descrito da mioglobina é o estresse oxidativo, no qual, a mioglobina após ser endocitada pelos túbulos proximais, pode passar de seu estado ferroso para férrico, resultando na peroxidação lipídica. A presença de mioglobina nos túbulos renais aumenta a expressão de HO-1, indicando possível papel do ferro do heme nesse processo. O heme livre é uma molécula pró- oxidante e pró-inflamatória, capaz de induzir a geração de EROs e de secreção de diversas citocinas. Exerce parte de seus efeitos ativando o receptor TLR4 em macrófagos na ausência de soro. No presente estudo nós mostramos que a mioglobina induziu a secreção de TNFα em macrófagos na ausência e presença de soro, e ainda na presença de albumina. Em macrófagos a mioglobina: induziu a secreção de TNF-α e citotoxicidade dependente de TLR4; induziu a secreção de RANTES, sugerindo a ativação da via de TRIF; ativou inflamassoma como primeiro sinal; ativou a enzima tirosina quinase SYK e foi capaz de induzir TNFα independentemente da geração de EROs. Nos experimentos in vivo, nós mostramos que no modelo experimental de rabdomiólise induzida por glicerol foi possível detectar a expressão de TN-Fα no plasma e IL-1β nos rins. Além disso, a letalidade causada por rabdomiólise foi dependente de TLR4 e MyD88. Esse conjunto de resultados sugerem que a mioglobina exerce parte de seus efeitos nocivos ativando receptores da imunidade inata e que esses receptores podem estar envolvidos como possíveis mecanismos na patogênese rabdomiólise.

Palavras-chave: Célula B-1, Rabdomiólise; Mioglobina; Heme; TLR4; Macrófagos; Espécies Reativas de Oxigênio (EROs); TNF-α; RANTES

Abstract

Myoglobin is an oxygen binding protein present in muscle cells. It contains a single polypeptide chain of 153 of known sequence aminoacids and a single iron porphyrin or heme group. This protein is the main nephrotoxin associated with damage to rhabdomyolysis. The mechanisms proposed for toxicity include tubular obstruction, oxidative injury, vasoconstriction, apoptosis and inflammation. Myoglobin induces the expression of adhesion molecules, transcription factors such as AP-1 and NFκB and proinflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β. Another myoglobin described effect is the oxidative stress, wherein the myoglobin after being endocytosed by the proximal tubule, can move from its ferrous to ferric state, resulting in lipid peroxidation. The presence of myoglobin in renal tubules increases the expression of HO-1, heme iron indicating a possible role in this process. Free heme is a pro-oxidant and proinflammatory molecule capable of inducing ROS generation and secretion of various cytokines. Exerts part of its effects by activating the TLR4 receptor on macrophages in the absence of serum. We investigated that myoglobin induced not only the secretion of TNF-α in macrophages in the absence and presence of serum but also in the presence of albumin. Myoglobin In macrophages: induced TNF-α secretion and TLR4-dependent cytotoxicity; induced secretion of RANTES suggesting the activation of the TRIF pathway; activated inflammasome as the first signal; activated SYK tyrosine kinase enzyme, and was able to induce TNF-α regardless of ROS generation. In in vivo experiments, we demonstrate that the experimental model of glycerol-induced rhabdomyolysis was possible to detect the expression of TNF-α in plasma and IL-1β in the kidneys. Furthermore, the lethality caused by rhabdomyolysis is dependent on TLR4 and MyD88. As a result, the present investigation suggests that part of myoglobin exerts its harmful effects by activating receptors of the innate immunity and that these receptors might be involved in the pathogenesis and possible mechanisms rhabdomyolysis.

Keyword: Rabdomyolysis; Myoglobin; Heme; TLR4; Macrophages; ROS; TNF-α; RANTES

Título

Título: Indução de aggresome-like induced structures (alis) em macrófagos murinos pelo heme e seus produtos de degradação.

Aluno(a): Ellen Kiarely de Souza

Orientador(es): Prof(a). Leonardo Holanda Travassos Correa

Resumo

Aggresome-like induced structures (ALIS) são agregados de proteínas poli ubiquitinadas formados em diversos tipos celulares em resposta a um estímulo bacteriano (LPS) e/ou decorrentes de diferentes tipos de estresse celular geradores de sinais de dano que acarretam o acúmulo de proteínas ubiquitinadas. Nesse trabalho, demonstramos que ALIS podem ser induzidos em macrófagos murinos pela molécula hemeprotoporfirina IX, uma vez que esta induz a co-localização de p62 e ubiquitina. Demonstramos também o importante papel da heme oxigenase (HO-1) e da degradação do heme na formação de ALIS. Demonstramos ainda que o ferro e o fator de transcrição Nrf2 são essenciais para formação de ALIS. Além disso, a ferritina desempenha um papel essencial da proteína ferritina na diminuição do número dessas estruturas. Finalmente, observamos em fibroblastos (MEFs ATG 5 -/- ), deficientes em autofagia, um aumento dessas estruturas em comparação aos fibroblastos selvagens, mostrando assim que os ALIS são degradados pela via autofágica

Palavras-chave: ALIS. Ferro. Macrófagos. Agregados de proteínas. HO-1

Abstract

Aggresome-like induced structures (ALIS) are aggregates that contain polyubiquitinated proteins, formed in various cell types. These structures arise in response to a bacterial stimulus (LPS) or different kinds of cellular stress, which signal damage, causing accumulation of ubiquitined proteins. In this study, we show that in murine macrophages, the formation of ALIS is induced upon stimulation with heme protoporphyrin IX, as evidenced by the co-localization of p62 and ubiquitin. We also demonstrated the important role of heme oxygenase (HO-1) and the degradation of heme in the formation of ALIS. We also demonstrated that iron is essential for the formation of these structures, which are also dependent on the transcription factor Nrf2. We show the essential role of the protein ferritin in reducing these structures. Finally, we observed in fibroblast (MEFs ATG cells 5 – / – ), deficient in autophagy an increase of these structures compared to wild type fibroblasts, suggesting that the ALIS are degraded by autophagic pathway.

Keyword: ALIS. Iron. Macrophage. Aggregates of proteins. HO-1.

Título

Título: O impacto da terapia com célula tronco mesenquimal (MSC) na infecção por Leishmania ssp.

Aluno(a): Joyce Carvalho Pereira

Orientador(es): Prof(a). Herbert Leonel de Matos Guedes

Resumo

A terapia celular tem como função restabelecer a estrutura e a função de um tecido através da utilização de uma célula ou de um grupo de populações celulares. Contra a leishmaniose ainda não há vacinas aprovadas, a quimioterapia é inadequada, pois há efeitos adversos e até o momento não existe uma terapia ideal e funcional. Neste trabalho, avaliamos o potencial, empregando células tronco mesenquimais (MSC) contra a leishmaniose cutânea e visceral murinas. No experimento in vitro, verificou-se que as MSCs não são infectadas pela Leishmania amazonensis. No entanto, a co-cultura de macrófagos infectados com MSC aumentou a carga parasitária em comparação com o controle (macrófago sem MSC). No experimento de leishmaniose cutânea murina, camundongos BALB/c foram infectados com 2×106 promastigotas de L. amazonensis (cepa Josefa) no coxim plantar da pata direita. Sete dias após a infecção, os animais foram tratados com 1×105 MSCs pela via intralesional (i.l.), ou seja, no mesmo local da infecção, ou pela via intravenosa (i.v.), na veia jugular externa. Animais controles receberam o mesmo volume (50µl) de PBS por vias i.l. ou i.v. Trinta dias após o primeiro tratamento, os animais receberam uma segunda administração de MSC. O perfil clínico da doença foi verificado pelo desenvolvimento da lesão, através da medida da espessura por paquimetria. Quarenta e dois dias após a infecção, os animais foram eutanasiados. A carga parasitária da pata e do linfonodo drenante foram quantificados pela técnica de diluição limitante (LDA). As células do linfonodo e baço foram avaliadas por citometria de fluxo para caracterização dos fenótipos celulares. O tratamento com MSC pela via i.v. induziu um pequeno agravamento da lesão. Os animais tratados com MSC i.v. apresentaram diferença significativa na carga parasitária da pata em relação ao seu controle e, a análise do perfil celular dos linfonodos, mostrou aumento de células T efetoras e T reguladoras nos animais. No baço, foi observado um aumento de células T reguladoras e da produção de IL-10 por células TCD4+ e TCD8+ e, na pata, também observamos um aumento de IL-10. A produção excessiva de IL-10 pode estar associada ao efeito de agravamento da doença pela terapia com MSC pela via i.v. No entanto, não foi observado qualquer efeito prejudicial no tratamento i.l. Nossos resultados demonstraram que as MSCs não contribuem para o controle da infecção. No experimento de leishmaniose visceral, camundongos BALB/c foram infectados com 1×107 promastigotas de L. infantum/chagasi pela via i.v. na cauda. A administração do tratamento com MSC i.v. (veia jugular externa) foram dadas 5 e 12 dias após a infecção. Após 30 dias os animais foram eutanasiados, a carga VIII parasitária do baço e do fígado foram quantificados por LDA. Ambos os órgãos apresentaram carga parasitária, porém sem diferença significativa entre os animais tratados com MSC em relação ao seu controle, mostrando que o tratamento não foi eficaz. Tomando em conjunto, nossos dados sugerem que o tratamento com MSC pode ter efeitos deletérios na leishmaniose cutânea e visceral murina

Palavras-chave: Leishmaniose; Leishmania amazonensis; Leishmania Infantum/chagasi; Célula Tronco Mesenquimal

Abstract

Cell therapy aims at restoring tissue structure and functionality through the use of a cell or a subpopulation of cells. For leishmaniasis there are still no approved vaccines, available chemotherapy is inadequate as there are side effects and, so far, there is no ideal and functional therapy. In this study, we evaluated the potential application of mesenchymal stem cells (MSC) treatment against murine cutaneous and visceral leishmaniasis. In vitro, we found that MSCs are not infected by Leishmania amazonensis. However, co-culture of infected macrophages with MSC increased parasite load on macrophages in comparison to controls (macrophage without MSC). In murine cutaneous leishmaniasis, BALB/c mice were infected with 2×106 L. amazonensis (strain Josefa) promastigotes in the footpad of the right paw. Seven days after infection, animals were treated with 1×105 MSCs, either intralesional (i.l.), i.e. in the same site of infection, or intravenously (i.v.), through the external jugular vein. Control animals received the same volume (50 µl) of PBS by routes i.l. or i.v. Thirty days after the first treatment, animals received a second administration of MSC. The clinical profile of the disease was checked by lesion development through the thickness measured by pachymetry. Forty-two days after infection, animals were euthanized. Parasite burden in the paw and in the draining lymph nodes were quantified by limiting dilution technique (LDA). Lymph node and spleen cells were phenotyped by flow cytometry. Intravenous treatment with MSC resulted in a small worsening of the injury. The animals treated with MSC i.v. presented a significant difference in parasite load in comparition with your controls and, the cellular profile analysis of lymph nodes showed an increase in effector and regulatory T cells in animals. Increased number of regulatory T cell and IL-10 producing T CD4+ and TCD8+ cells in the spleen, and upregulation of IL-10 in the footpad. The excessive production of IL-10 could be associated to the diseaseaggravating effects of MSC therapy by the i.v. route. On the other hand, it was not observed any harmful effect on i.l. treatment. Our results showed that stem cells do not contribute to the infection control in cutaneous leishmaniasis. In the experiment of visceral leishmaniasis, BALB/c mice were infected with 1×107 promastigotes of L. infantum/chagasi by i.v. route in tail. Administration of treatment with MSC i.v. (jugular vein) was injected in 5 and 12 days after infection. After 30 days, animals were euthanized, the parasitic load of spleen and liver were quantified by LDA. Both organ showed parasitic load, but with no significant difference between the animals treated MSCs compared to their controls, showing that the treatment was not effective. Having together, our data X suggest that treatment with MSC may have deleterious effects on murine cutaneous and visceral leishmaniasis.

Keyword: Leishmaniasis; Leishmania amazonensis; Leishmania infantum / chagasi; Mesenchymal stem cell

Título

Título: Caracterização do impacto estimulatório do ácido nordihidroguaiarético (NDGA) no metabolismo lipídico de macrófagos.

Aluno(a): Maria Nathalia de Lira

Orientador(es): Profa. Christianne Bandeira de Melo

Resumo

Os macrófagos desempenham um papel central na interface entre a imunidade inata e adaptativa, tornando se alvos de diversos estudos. O NDGA é uma molécula que possui diversos mecanismos de ação ainda não muito bem elucidados. Em macrófagos murinos, o NDGA é capaz de promover rápida liberação de ATP através da panexina-1, produz um influxo de cálcio e dispara um mecanismo de captura de corantes catiônicos. Neste trabalho buscamos entender como o NDGA, que dentre vários mecanismos de ação, é principalmente descrito como inibidor da enzima 5-LO, afeta os corpúsculos lipídicos, o principal compartimento intracelular de síntese de eicosanoides. Neste estudo utilizamos macrófagos peritoneais murinos estimulados com NDGA 50 µM com tempos de incubação variados, e avaliamos o influxo de cálcio, liberação de ATP, produção de mediadores lipídicos e o conteúdo citoplasmático de corpúsculos lipídicos. Nosso estudo caracterizou que o NDGA é capaz de diminuir a quantidade de corpúsculos lipídicos do citoplasma de macrófagos murinos de forma rápida e duradoura (perdura por no mínimo 24 h). Além disso, o rápido desaparecimento é acompanhado de uma diminuição específica da secreção do prostanoide TXB2, sem afetar a síntese de outros eicosanoides em até 10 min de estimulação, incluindo os metabólitos da 5-LO, o cys-LT. O efeito sobre a quantidade de corpúsculos lipídicos também ocorre em macrófagos ativados com LPS e, pelo menos, em mais um tipo celular, os eosinófilos. O mecanismo de ação envolvido no desparecimento de corpúsculos lipídicos induzido por NDGA não envolve a modulação da via da 5-LO, intermediação por PGD2, ou uma atividade autócrina/parácrina por ATP secretado, visto que (i) outros inibidores da enzima 5-LO não reproduzem os efeitos do NDGA; (ii) o inibidor da H-PGDS não afeta os efeitos do NGDA em macrófagos; e (iii) ao degradarmos o ATP liberado com apirase ou ao impedirmos sua liberação via panexina-1 com o uso do carbenoxolone, o efeito de desaparecimento de corpúsculos lipídicos ainda é preservado. Parte do mecanismo envolvido no efeito do NDGA para a rápida degradação de corpúsculos lipídicos parece estar associado a uma ativação de proteossoma, visto que seu inibidor clássico, o bortezomib, impede a rápida diminuição tanto do número destas organelas como da síntese de TXB2 induzida por NDGA. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar o rápido efeito de degradação de corpúsculos lipídicos em macrófagos pela ação do NDGA com a participação do proteossoma. No entanto, estudos complementares fazem-se necessários para melhor entender o impacto dessa diminuição abrupta de corpúsculos lipídicos na fisiologia da resposta imune no contexto de doenças inflamatórias e distúrbios neuro-imuno-endocrinos

Palavras-chave: macrófago; NDGA; corpúsculos lipídicos; proteossoma

Abstract

Macrophages play a central role in the interface between innate and adaptive immunity, making it the target of several studies. The NDGA is a molecule that has multiple mechanisms of action not yet well understood. In murine macrophages, the NDGA is able to promote rapid release of ATP by pannexin-1, produces calcium influx and triggers a dye uptake mechanism. In this work we understand how NDGA which of several mechanisms action is mainly described as an inhibitor of 5-LO enzyme, affects the lipid bodies, the main intracellular compartment of eicosanoid synthesis. In this study, we used murine peritoneal macrophages stimulated with NDGA 50 µM with varying incubation times and evaluated calcium influx, ATP release, production of lipid mediators, and the cytoplasmic contents of lipid body. Our study characterized that NDGA is able to decrease the amount of lipid bodies in the cytoplasm of murine macrophages (lasting for at least 24 h). Furthermore, the rapid disappearance is accompanied by a specific reduction in TXB2 prostanoid secretion without affecting the synthesis of the other eicosanoids at least 10 min of stimulation, including the metabolites of 5-LO, the cys-LT. The effect on the amount of lipid bodies also occurs in macrophages activated with LPS and at least in another cell type, eosinophils. The mechanism of action involved in the disappearance of lipid bodies induced by NDGA does not involve: modulation of the 5-LO, intermediation of PGD2 or an autocrine/paracrine ATP secreted activity, as: (i) other inhibitors of 5-LO enzyme do not reproduce the effects of NDGA; (Ii) H-PGDS inhibitor does not affect the effects of NDGA in macrophages; and (iii) the degradation of released ATP with apyrase or preventing of its release via panexina-1 with the use of carbenoxolone, the disappearance of lipid body effect is still preserved. Part of the mechanism involved in the effect of NDGA to rapid degradation of lipid bodies seems to be associated with a rapid activation of proteasome, whereas its classic inhibitor, bortezomib, prevents rapid decrease of both the number of these organelles such as the TXB2 synthesis NDGA induced. Our work is pioneer in demonstrating the rapid effect of lipid body degradation in macrophages by the action of NDGA with the participation of the proteasome. However, further studies are required in order to better understand the impact of the abrupt decrease in lipid body in the physiology of the immune response in the context of inflammatory diseases and neuro-immune-endocrine disorders.

Keyword: macrophage; NDGA;l ipid bodies;p roteasome

Título

Título: Caracterização da formação de aggresome-like induced structures (alis) em macrófagos murinos estimulados com ligantes de receptores do tipo toll.

Aluno(a): Mariana da Silva Siqueira

Orientador(es): Prof(a). Leonardo Holanda Travassos Correa

Resumo

Aggresome-like induced structures (ALIS) são agregados de proteínas ubiquitinadas formados em células dendríticas e macrófagos, bem como em diversas linhagens celulares, após a estimulação com LPS ou diferentes estímulos estressores. No entanto, ainda é desconhecido se outros agonistas de TLRs são capazes de induzir estas estruturas, bem como o envolvimento de diferentes TLRs e as cascatas de sinalização envolvidas neste processo. Neste trabalho, demonstramos que ALIS também podem ser induzidos em macrófagos murinos mediante a estimulação com Pam3CSK4 (TLR2), R848 (TLR7), DNA CpG (TLR9), Poly (I:C) (TLR3) e imiquimode (TLR7), uma vez que estes induzem a co-localização de p62 e ubiquitina em agregados proteicos nestas células. Por outro lado, a estimulação com flagelina (TLR5) não induz a formação de ALIS. Demonstramos também que a estimulação de macrófagos murinos com agonistas de TLRs indutores de ALIS promove o aumento da expressão de p62 e que a expressão de TLR4 e TLR2 nestas células é essencial para a indução da formação de ALIS por LPS e Pam3CSK4, respectivamente. A inibição da MAPK JNK reduz a formação de ALIS por R848 mas não por Pam3CSK4 e LPS. Demonstramos ainda que espécies reativas de oxigênio possuem um papel parcial na indução de ALIS por R848, mas não são necessárias para a formação destas estruturas mediante a estimulação com LPS ou Pam3CSK4. Finalmente, observamos um maior número de ALIS em MEFs ATG5–/– , deficientes em autofagia, em comparação as MEFs controle, o que sugere a participação da via autofágica para a remoção destas estruturas após sua formação. Nossos resultados sugerem a participação de diferentes TLRs, com exceção do TLR5, no processo de indução de ALIS.

Palavras-chave: ALIS. TLRs. Agregados de proteínas. Macrófagos.

Abstract

Aggresome-like induced structures (ALIS) are aggregates that contain ubiquitinated proteins and are induced in dendritic cells and macrophages, as well as in various cell lines, upon stimulation with LPS or different cellular stressors. However, it is currently unknown whether other TLR agonists are also able to induce such structures. The role of different TLRs other than TLR4 and the signaling cascades involved also remain to be elucidated. In this study, we show that, in murine macrophages, the formation of ALIS is induced upon stimulation with Pam3CSK4 (TLR2), R848 (TLR7), DNA CpG (TLR9), Poly (I:C) (TLR3) and imiquimode (TLR7), as evidenced by the co-localization of p62 and ubiquitin in protein aggregates in these cells. On the other hand, stimulation with flagelin (TLR5) did not induce ALIS formation. We also show that stimulation of murine macrophages with TLR agonists that induce ALIS formation results in increased p62 expression and that the expression of TLR4 and TLR2 is essential for ALIS formation induced by LPS and Pam3CSK4, respectively. Inhibition of the MAPK JNK results in decreased ALIS formation in response to R848, but not to Pam3CSK4 or LPS. We further demonstrate that reactive oxygen species are partially involved in ALIS formation induced by R848 but are dispensable for the formation of these structures in response to LPS or Pam3CSK4. Finally, we observed an increased number of ALIS in autophagy defective ATG5-/- MEFs, when compared to wild-type controls, suggesting that the autophagic pathway is involved in the clearance of these structures after its formation. Our results reveal the participation of different TLRs, with the exception of TL5, in the process of ALIS formation.

Keyword: ALIS. TLRs. Protein aggregates. Macrophages

Título

Título: Mecanismos envolvidos na liberação de redes extracelulares de dna (nets) por neutrófilos humanos em resposta ao reconhecimento do fungo Aspergillus fumigatus

Aluno(a): Juliana da Costa Silva

Orientador(es): Prof(a). Rodrigo Tinoco Figueiredo

Resumo

Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na imunidade a infecções fúngicas como observado pela elevada suscetibilidade a estas infecções em indivíduos neutropênicos. Recentemente, foi descrito um novo mecanismo que consiste na liberação de redes DNA para o meio extracelular por neutrófilos, eosinófilos, basófilos e macrófagos. Em neutrófilos, patógenos como bactérias, protozoários e fungos são capazes de induzir a liberação de DNA, porém os mecanismos de sinalização envolvidos em tal resposta ainda são poucos compreendidos. O fungo Aspergillus fumigatus é o principal agente causador das aspergiloses invasivas (AI), condições que apresentam uma alta taxa de mortalidade, acometendo principalmente pacientes submetidos a transplantes de medula óssea e neutropênicos. Deste modo, a investigação das respostas e mecanismos envolvidos na imunopatogênese das infecções causadas por este fungo são fundamentais para a compreensão da patogênese e terapêutica da aspergilose invasiva. Neste trabalho avaliamos os mecanismos de sinalização envolvidos na liberação de redes de DNA (NETs – Neutrophil Extracellular Traps), por neutrófilos humanos em resposta ao fungo A. fumigatus e a β(1,3)-glucana, curdlana. Nossos resultados demonstram que a indução de NETs envolve a participação de β2 integrinas como CD11b/CD18, requer a sinalização mediada por Syk, e a geração de ROS pelo complexo NADPH oxidase. Além disso, observamos que o estímulo com conídios de A. fumigatus, é capaz de promover a citrulinação de histonas H3, porém a liberação do DNA não depende da citrulinação de histonas. Sendo assim, nosso trabalho descreve pontos importantes da via de sinalização envolvida na liberação de NETs frente ao fungo, A. fumigatus

Palavras-chave: Quitina, macrófagos, neutrófilos, TNF

Abstract

Chitin is the most abundant natural polysaccharide after cellulose, and is an important component of the fungal cell wall, the exoskeleton of insects and the cuticle of helminths. The exposure to chitin is related to allergic processes. Chitin is capable to induce the secretion of cytokines by macrophages, leukocyte recruitment and alternative macrophage activation, besides to contribute for the bronchial hyper-reactivity in models of inflammation induced by the administration of chitin. Although immunomodulatory effects have been attributed to chitin, the mechanisms that promote these effects are not known due to the great controversy regarding chitin purity, particle size, different preparation processes and populations of cells analyzed. Toll-like receptor 2 (TLR2), dectin-1 and the mannose receptor (MR) have been identified as involved in chitin recognition, but the role of these receptors and their responses have been challenged, since they have been attributed to the contamination of the used chitin preparations. This work has the goal to evaluate the macrophage, epithelial cell lines and neutrophil responses to purified chitin. Our results demonstrate that chitin does not induce macrophage TNF production in vitro,, but is capable to bind to these cells. In vivo, chitin induced neutrophilia, TNF production and alveolar macrophages arginase-I activity. Furthermore, a mass spectrometric analysis of RAW cell membrane precipitated with chitin particles identified CD18 as a protein capable to interact with chitin, as well as talin and MARCKS, proteins associated to integrins and phagocytic processes. Chitin particles promoted the reactive species of oxygen (ROS) production by human neutrophils and neutrophils extracellular traps (NET) release. Thus, our results demonstrate that chitin particles are capable to activate neutrophils in vitro and promote pro-inflammatory responses in a model of lung inflammation. In contrast, the in of chitin particles does not promote the release of cytokines by macrophages or epithelial cells or even alternative macrophage activation.

Keyword: Chitin, macrophages, neutrophils, TNF

Título

Título: Alterações na homeostase de células T reguladores em idosos: influência da involução tímica e da dinâmica populacional periférica.

Aluno(a): Pedro Henrique Oliveira Vianna

Orientador(es): Prof(a). Adriana Cesar Bonomo

Resumo

Um equilíbrio delicado entre células T reguladoras CD4+ Foxp3+ (Treg) e a população de linfócitos TCD4+Foxp3- convencionais (Tconv) no compartimento periférico, mantido estável durante a maior parte do tempo de vida, é essencial para a preservação da auto-tolerância, em paralelo à geração de respostas imunológicas eficientes. Indivíduos idosos apresentam aumento da população de Treg que pode estar associada a imunodeficiência do idoso. O principal objetivo deste trabalho foi analisar o papel da involução tímica e da homeostase periférica sobre a frequência das células T reguladoras periféricas CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) em camundongos idosos. Nossos resultados mostraram que alterações quantitativas da emigração de células T do timo podem alterar a homeostase Treg/Tconv independentemente do estado de envelhecimento do compartimento periférico. Camundongos jovens timectomizados apresentaram aumento progressivo na frequência de células Treg, enquanto o enxerto de um timo funcional jovem em camundongos idosos restaurou a proporção fisiológica de células Treg / Tconv encontrada no animal jovem. Surpreendentemente, as células T derivadas de esplenócitos de doadores jovens ou idosos colonizaram a periferia linfopênica de hospedeiros RAG -/- com a mesma eficiência, levando a números elevados de células Treg em ambos os grupos. Na ausência de emigração tímica, a população de células Treg parece sobreviver por mais tempo, tal como confirmado pela sua baixa percentagem de células Anexina-V+ . Nossos dados sugerem que a população que emigra do timo, contendo uma proporção adequada de linfócitos Treg/Tconv pode ser essencial para manter o equilíbrio entre células Treg e Tconv, que é perdido na ausência do timo, independentemente de alterações no ambiente periférico ou na biologia das células T, associadas ao envelhecimento

Palavras-chave: Envelhecimento, Timo, Células T regulatórias, Homeostase, Linfopenia, Imunosenescência

Abstract

A tight balance between regulatory CD4+Foxp3+ (Treg) and conventional CD4+Foxp3- (Tconv) T cell subsets in the peripheral compartment, maintained stable throughout most of lifetime, is essential for preserving self-tolerance along with efficient immune responses. An excess of Treg cells, described for aged individuals, may critically contribute to their reported immunodeficiency. In this work, we show that quantitative changes in thymus emigration alter the Treg/Tconv homeostasis regardless of the aging status of the peripheral compartment Thymectomized young mice presented a progressive increase in the Treg cell frequency, while the grafting of a functional young thymus in aged mice restored the young-like physiological Treg/Tconv proportion. Strikingly, T cells derived from young or aged splenocytes colonized the lymphopenic periphery of RAG-/- hosts to the same extent, giving rise to similarly elevated Treg cell levels irrespective of the age of the donor population. In the absence of thymus output, the Treg subset seems to survive longer, as confirmed by their lower proportion of Annexin-V+ cells. Our data suggest that the thymusemigrating population, harboring an adequate proportion of Treg/Tconv lymphocytes, may thus be essential to keep the Treg cell balance, independently of age-related shifts intrinsic to the peripheral environment or to the T cell biology.

Keyword: Ageing, Thymus, Regulatory T cells, Homeostasis, Lymphopenia, Immunosenescence

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