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DISSERTAÇÕES
Papel imunomodulador dos linfócitos b na infecção experimental por leishmania amazonensis.
Título
Título: Papel imunomodulador dos linfócitos b na infecção experimental por leishmania amazonensis.
Aluno(a): Luan Firmino Cruz
Orientador(es): Prof(a). Herbert Leonel de Matos Guedes
Resumo
As Leishmanioses são um complexo de doenças negligenciadas e Leishmania amazonensis é o agente etiológico da leishmaniose cutânea difusa no Brasil. Os linfócitos B, ao contrário dos linfócitos T, ainda não têm papel bem definido nos modelos de infecção por parasitos do gênero Leishmania. Enquanto alguns trabalhos indicam um papel patogênico para esta população, outros indicam papel protetor e, por esse motivo, mais estudos a respeito destas células no contexto de infecção por parasítos do gênero Leishmania são necessários. Este trabalho tem como objetivo estudar a imunomodulação de linfócitos B durante o curso da infecção por L. amazonensis. Primeiramente, nós infectamos animais selvagens BALB/c (WT) e identificamos uma mudança no perfil do linfócito B1 peritoneal, com um aumento da população de linfócito B1b acompanhado de redução da população de linfócito B1a comparados às mesmas populações em animais não-infectados. Além disso, foi identificada também uma produção aumentada de IL-10 majoritariamente feita por linfócitos B2, quando comparados com linfócitos B2 derivados de animais nãoinfectados e com linfócitos T. Baseado nestes achados, avaliamos a infecção por L. amazonensis usando o modelo animal BALB/Xid, que apresenta baixo número de linfócitos B1 e redução na capacidade de ativação de linfócitos B2. Os camundongos foram infectados no coxim plantar e eutanasiados após 60 dias de infecção. Nossos resultados demonstraram que animais BALB/Xid desenvolveram menores lesões em VIII comparação com animais controle. Entretanto, não houve diferença nas cargas parasitárias obtidas no sítio da lesão, linfonodo drenante e baço de animais de ambos os grupos. Nós avaliamos a população de linfócitos B1 peritoneais em animais BALB/Xid, que é muito reduzida em relação aos WT; diferentemente do que foi encontrado nos animais WT, nós não observamos nenhuma diferença nas subpopulações B1a e B1b nos animais BALB/Xid infectados em comparação com o grupo não infectado. Nós observamos uma redução no número de linfócitos B2 de animais BALB/Xid em relação aos camundongos WT nos linfonodos drenantes de lesão. Camundongos BALB/Xid apresentaram menores níveis de IgM, IgG e IgG1 no soro quando comparados com animais WT, provavelmente por causa do baixo número de linfócitos B2. Não houve diferenças nos números de células CD8+ , CD4+ , CD4+ IFNg+ e T reguladoras (ou TReg, CD3+CD4+CD25+ FoxP3+ ) entre animais BALB/Xid e animais WT no linfonodo drenante da lesão. Animais BALB/Xid apresentaram níveis mais baixos de IL-10 no sítio da lesão, linfonodo drenante e no baço quando comparados com os mesmos tecidos de animais WT. Não detectamos diferenças no número de linfócitos T CD4+ e T CD8+ produtores de IL-10 entre camundongos WT e BALB/Xid; entretanto, animais BALB/Xid apresentaram números inferiores de linfócitos B2 produtores de IL-10 em comparação com animais WT. Para investigar a participação dos linfócitos B1 na produção de IL-10, nós cultivamos linfócitos B1 peritoneais estimulados ou não com LPS na presença ou ausência de L. amazonensis na forma promastigota. Linfócitos B1 foram capazes de produzir maiores quantidades de IL-10 quando estimulados com L. amazonensis e LPS em comparação com os controles. Nós isolamos cultivamos linfócitos B1 peritoneais de animais WT infectados e não infectados e os estimulamos com L. amazonensis nas formas promastigota e amastigota. Nós observamos que linfócitos B1 derivados de animais infectados, produziram mais IL-10 quando estimulados por amastigotas. Nós demonstramos que linfócitos B2 e B1 de animais infectados produzem IL-10 em experimentos ex vivo. Juntos, nossos dados indicam que linfócitos B estão associados com a patogênese relacionada à lesão, mas não à carga parasitária, na leishmaniose cutânea murina causada por Leishmania amazonensis através da produção de IgM, IgG e IL-10.
Palavras-chave: Leishmania amazonensis; Leishmaniose cutânea; IgM; IgG; IgG1; IL-10; linfócito B;
Abstract
Leishmaniasis is a complex of neglected diseases and Leishmania amazonensis is the etiological agent of diffuse cutaneous leishmaniasis in Brazil. This work aims to study the immunomodulation of B lymphocytes during the course of L. amazonensis infection. Firstly, we infected BALB/c (WT) mice and identified a change in peritoneal B1 profile marked by an increase of B1b population and a decrease of B1a on infected WT mice in relation to naïve WT mice, besides that, the major source of IL10 was from B2 cell in comparison with T cells. Based on this finding, Leishmania amazonensis infection was evaluated using BALB/Xid mice as model that present lower number of B1 and reduction on activation capacity of B2 cells. Mice were infected on the footpad and euthanized at 60th day post infection. Our results demonstrated that BALB/Xid mice developed smaller lesions in comparison to WT control. However, the parasite load obtained from the infected footpad, spleen and lymph nodes were similar in both groups. We evaluated the peritoneal B1 population on BALB/Xid mice that is reduced in relation to WT mice; differently from what has been found in WT mice, we did not observe any difference in B1a and B1b in infected mice in comparison with naïve BALB/Xid mice. We observed a reduction in the number of B2 cells from BALB/Xid mice in relation to WT mice in the lymph nodes. BALB/Xid mice presented lower levels of IgM, IgG and IgG1 in the serum when compared with WT mice, probably due to the lower number of B2 cells. There was no difference in the number of CD8+ , CD4+ , CD4+ IFNg+ and regulatory T (TReg) cells (CD3+CD4+CD25+ FoxP3+) between BALB/Xid and WT mice in the draining lymph node. BALB/Xid mice presented lower levels of IL-10 in the infected footpad, draining lymph nodes and in the spleen when compared with WT infected tissues. We could not detect differences between the number of IL-10 producing T CD4+ cells and T CD8+ cells in WT and BALB/Xid mice; however, a strong reduction of IL-10 producing B2 cells was noted in BALB/Xid mice. To investigate the participation of B1 in IL-10 production, we performed in vitro interaction using peritoneal B1 lymphocytes stimulated by LPS in the presence or absence of L. amazonensis. B1 lymphocytes were able to produce higher levels of IL-10 when exposed to L. amazonensis plus LPS in comparison with the controls. We isolated and cultured B1 cells from naïve and infected mice and we stimulated with promastigotes and mastigotes, we observed that B1 cells from infected mice produced IL-10 stimulated by amastigotes. We demonstrated that B2 and B1 cells from infected mice produce IL-10 in ex vivo experiments. Together, our data indicate that B cells are associated with lesion pathogenesis in murine cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis through the production of IgM, IgG1 and IL-10, but not with the parasite load.
Keywords: Leishmania amazonensis; Cutaneous leishmaniasis ;IgM; IgG; IgG1; IL10; B lymphocyte
O papel do Inflamossomo na Imunopatogênese da asma experimental causada pela exposição crônica ao aspergillus fumigatus.
Título
Título: O papel do Inflamossomo na Imunopatogênese da asma experimental causada pela exposição crônica ao aspergillus fumigatus.
Aluno(a): Marcella Almeida Azevedo Detoni
Orientador(es): Prof(a). Rodrigo Tinoco Figueiredo
Resumo
A asma é uma doença caracterizada pela inflamação crônica das vias aéreas, existindo duas características marcantes, a inflamação crônica e o remodelamento, resultando na principal manifestação fisiopatológica, que é a hiper-reatividade das vias aéreas. A resposta brônquica exagerada pode ser induzida por fatores ambientais como alérgenos, entre eles os fungos. Em humanos, uma associação entre a exposição aos fungos, em particular ao Aspergillus fumigatus, e a asma é reconhecida clinicamente e epidemiologicamente. Corroborando os estudos epidemiológicos, modelos experimentais de indução de inflamação alérgica pulmonar em camundongos podem ser mimetizados pela imunização e/ ou desafio com antígenos ou conídios do A. fumigatus. Componentes da parede celular do A. fumigatus servem como ligantes para receptores de reconhecimento de padrão (PRRs). Entre os PRRs, as células hospedeiras podem ser equipadas com receptores de reconhecimento de padrão citoplasmáticos capazes de desencadear a montagem do inflamossomo. Os inflamossomos são plataformas de sinalização molecular que controlam a ativação da caspase-1. O inflamossomo NLRP3 têm sido implicado no desenvolvimento de asma, no entanto, o papel do inflamassomo na inflamação alérgica pulmonar é controverso. Logo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do inflamossomo na imunopatogênese da asma experimental causada por exposição crônica ao A.fumigatus. No modelo de exposição crônica ao A. fumigatus que desenvolvemos os camundongos Casp1-/-Casp11Sv129def que foram desafiados com A. fumigatus apresentaram maior hiper-reatividade das vias aéreas, inflamação pulmonar com eosinofilia e produção de muco quando comparados aos camundongos selvagens desafiados com o fungo. Estes resultados em conjunto mostram inflamação pulmonar e patologia aumentadas na ausência de caspase-1/11, sugerindo um papel modulador negativo da caspase1 e /ou caspase-11 na inflamação alérgica pulmonar no modelo de exposição crônica ao A. fumigatus.
Palavras-chave: asma; inflamossomo; Aspergillus fumigatus; fungo;caspase-1; conídios; crônica
Abstract
Asthma is a disease characterized by chronic airway inflammation, with two marked features: chronic inflammation and remodeling, resulting in the main pathophysiological manifestation, which is airway hyperreactivity. Exaggerated bronchial response may be induced by environmental factors such as allergens, including fungi. In humans, an association between exposure to fungi, in particular Aspergillus fumigatus, and asthma is clinically and epidemiologically recognized. Corroborating epidemiological studies, experimental models of pulmonary allergic inflammation induction in mice can be mimicked by immunization and / or challenge with A. fumigatus antigens or conidia. A. fumigatus cell wall components serve as ligands for pattern recognition receptors (PRRs). Regarding PRRs, host cells may be equipped with cytoplasmic PRRs, which are capable of triggering inflammassome assembly. Inflamamosomes are molecular signaling platforms that control caspase-1 activation. NLRP3 inflamossome has been implicated in the development of asthma; however, its role in allergic lung inflammation is controversial. Thus, this project aim was to evaluate inflammassome role in experimental asthma immunopathogenesis caused by chronic exposure to A. fumigatus. In A. fumigatus chronic exposure model, Casp1 -/- Casp11Sv129def mice that were challenged with A. fumigatus showed greater airway hyperresponsiveness, pulmonary inflammation with eosinophilia and mucus production when compared to wild-type mice challenged with fungus. These results show increased pulmonary inflammation and pathology in the absence of caspase-1/11, suggesting a negative modulatory role of caspase-1 and / or caspase-11 in pulmonary allergic inflammation in A. fumigatus chronic exposure model.
Keywords: asthma; inflammassome; Aspergillus fumigatus; fungus;caspase-1; conidia; chronic
Diversidade Funcional de Vesículas Extracelulares Fúngicas na Interação com Células Dendríticas e Influência na Patogênese.
Título
Título: Diversidade Funcional de Vesículas Extracelulares Fúngicas na Interação com Células Dendríticas e Influência na Patogênese.
Aluno(a): Leandro Honorato de Amorim
Orientador(es): Prof(a). Leonardo Nimrichter
Resumo
As espécies do gênero Candida são os principais causadores de infecções fúngicas, com destaque para Candida albicans (Ca) e Candida parapsilosis (Cp). Nos últimos anos tem se investigado o papel das vesículas extracelular (VEs) na interação com células hospedeiras, comunicação entre células e remodelamento da parede celular. Contudo, como as células do hospedeiro reconhecem e respondem a estas VEs, assim como as VEs influenciam na virulência do fungo carecem de mais estudos. Neste contexto, investigamos a resposta de células diferenciadas da medula com GMCSF de camundongos C57BL/6 Wild Type, TLR4 -/- , TLR2 -/-, CLEC7a -/- e MyD88 -/- após o estímulo com VEs de Ca e Cp mostrando uma redução acentuada na resposta de citocinas nas células deficientes de TLR4 -/- e MyD88 -/- . Enquanto os resultados de citometria de fluxo e western blot indicam que apesar da participação de TLR4 na produção de citocina, este receptor parece não ser o único responsável pela expressão de moléculas co-estimulatórias e da ativação do Fator Nuclear Kappa B (NFkB), sugerindo a ação de outro(s) receptor(es) no reconhecimento. Com o uso de cepas de Ca mutantes em N- manana e N- e O- manana observou-se que a secreção da interleucina 6 foi reduzida e aumentada, respectivamente, indicando que alterações no padrão de manosilação influenciam na resposta do hospedeiro. O padrão de manosilação também parece influenciar o tamanho e a bigênese das VES. Por outro lado, os dados de interação das VEs de Ca com a própria Candida mostram que o seu pré-tratamento com as VEs durante 24 horas reduziram sua virulência, enquanto a administração simultânea de VEs de Ca e o fungo aumentam a virulência em um modelo de Galleria mellonella. Esses dados sugerem que as VEs têm um papel importante tanto no hospedeiro quanto no próprio fungo de maneira distinta.
Palavras-chave: Candida parapsilosis; vesículas extracelular
Abstract
Candida species are the main cause of fungal infections, especially Candida albicans (Ca) and Candida parapsilosis (Cp). In recent years the role of extracellular vesicles (EVs) in the interaction with host cells, cell communication and cell wall remodeling has been investigated. However, the mechanism by which host cells recognize and respond to these EVs, as well as EVs influence the virulence requires further studies. In this context, we investigated the response of GM-CSF bone marrow derived cells from C57BL/ 6 wild-type mice, TLR4 – / – , TLR2 – / – , CLEC7a – / – and MyD88 – / – mice after stimulation with EVs from Ca and Cp. A marked reduction in the cytokine response in TLR4 – / – and MyD88 – / – deficient cells was observed. While the results of flow cytometry and western blot indicated that despite the influence of TLR4 on cytokine production, TLR4 seems not to be the only responsible for the expression of costimulatory molecules and the activation of the Nuclear Kappa B Factor (NFkB), suggesting the action of other receptors during EVs recognition. With the use of Ca mutants in Nmannan and N-and O-mannan it was observed that the secretion of interleukin 6 was reduced and increased, respectively, indicating that changes in the mannosylation pattern influence on the host response. In addition, the glycan chain of mannoproteins also seems to modify the size and biogenesis of EVS. On the other hand, the interaction data of Ca VEs with Candida itself showed that their pre-treatment with EVs for 24 hours reduced significative their virulence, while the simultaneous administration of Ca EVs and fungus increased virulence in a model of Galleria mellonella. Together, these data indicate that EVs play an important role both in the host and in the fungus itself in a different way.
Keywords: Candida species; Candida parapsilosis; fungal infections
O papel da il-18 na modulação da resposta de linfócitos t γδ durante a infecção experimental por trypanosoma cruzi.
Título
Título: O papel da il-18 na modulação da resposta de linfócitos t γδ durante a infecção experimental por trypanosoma cruzi.
Aluno(a): Julia Barbalho da Mota
Orientador(es): Prof(a). Ana Carolina de Siqueira Couto de Oliveira
Resumo
Os linfócitos T γδ apresentam características inatas e adquiridas, desempenhando papéis importantes na modulação de respostas imunes e respondendo a patógenos. Recentemente, estudos tem demonstrado que a citocina IL-18 (i) aumenta a expansão e ativação de linfócitos T γδ, os quais produzem altos níveis de citocinas pró-inflamatórias como IFNγ/TNFα, (ii) induz a polarização para um fenótipo de citotoxicidade contra células tumorais e (iii) sinaliza intrinsicamente em células T αβ, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta Th1 protetora durante a infecção por Trypanosoma cruzi. Diferentes subtipos de células T participam da resistência à infecção por este parasita, no entanto, pouco se sabe sobre o papel dos linfócitos T γδ neste contexto. Os objetivos principais do nosso trabalho foram (i) avaliar o fenótipo das células T γδ durante a infecção aguda por T.cruzi e (ii) estudar a importância da sinalização por IL-18 nestas células no contexto da infecção. Na primeira parte do nosso trabalho, utilizamos camundongos C57BL/6 infectados intraperitonealmente (i.p.) com 2 x 10³ tripomastigotas sanguíneos da cepa Y de T. cruzi para avaliar o perfil das células T γδ ao longo da infecção. Observamos que as células T γδ esplênicas expandem principalmente entre 14 e 21 dias pós-infecção (dpi). De forma semelhante ao encontrado no baço, a cinética do infiltrado intracardíaco de células T γδ durante a infecção por T. cruzi revelou que o pico ocorre por volta de 14 dpi e gradualmente reduz até 21 dpi. A curva de parasitismo intracardíaco, medida por PCR quantitativo, seguiu a cinética do infiltrado de células T γδ, indicando um possível papel dessas células no controle da infecção por T. cruzi. A fim de avaliar o papel de vias de sinalização dependentes da molécula adaptadora MyD88 na expansão de células T γδ, nós infectamos animais MyD88-/- (infecção i.p. com 2 x 10³ tripomastigostas sanguíneos da cepa Y) e avaliamos comparativamente à animais C57BL/6 (selvagens) os percentuais de linfócitos T γδ no baço e no coração com 14dpi. Nós observamos que as células T γδ foram significativamente reduzidas nos animais nocautes quando comparados aos animais selvagens, tanto no baço quanto no coração. Em seguida, avaliamos especificamente a influência da sinalização por IL-18R, via dependente de MyD88, nas células T γδ durante a infecção por T. cruzi. Experimentos in vitro com células T γδ purificadas do baço de animais WT e IL-18R-/- infectados demonstraram que as células T γδ IL18R-/- expandem menos e são menos ativadas (CD27+, produtoras de IFN- γ ou GzB+, citotóxicas) do que células T γδ WT após estimulo em cultura. Esse fenótipo foi corroborado por experimentos in vivo, onde animais IL-18R-/- infectados (14 dpi) apresentaram frequências reduzidas de células T γδ no baço e no coração. Além disso, as células T γδ citotóxicas GranzimaB+ e efetoras IFNγ+ também foram reduzidas no baço de camundongos IL-18R-/- em relação aos WT. Em seguida, realizamos experimentos de citotoxicidade in vitro para avaliar comparativamente o potencial citotóxico de células T γδ WT e IL-18R-/- frente a macrófagos infectados por T. cruzi. Observamos que as células WT apresentam citotoxicidade aumentada em relação às células IL-18R-/-. Por fim, com o intuito de investigar o papel protetor de células T γδ, realizamos a transferência adotiva de células T γδ WT para animais IL-18R-/-, susceptíveis a infecção. Observamos que a transferência é capaz de reverter a mortalidade dos animais nocautes, além de reduzir a parasitemia em relação aos animais não transferidos. Dessa forma, nossos resultados demonstram que a sinalização por IL-18R/MyD88 contribui para a expansão e ativação de células T γδ durante a infecção aguda por T. cruzi, sendo essas células importantes para o controle do parasitismo e modulação da resposta imune via produção de IFN-γ, favorecendo, portanto, a resolução da infecção.
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi; IL-18;linfócitos T γδ; citotoxicidade; IFN-γ; resposta imune Th1
Abstract
Gamma-delta T cells present innate and acquired immunity properties and play important roles in modulating immune responses and responding to pathogens. Recently, studies have shown that the cytokine IL-18 (i) enhances γδ T cell expansion and activation, which produce high levels of proinflammatory cytokines such as IFNγ / TNFα, (ii) induces a cytotoxic phenotype of γδ T cells against tumor cells and (iii) contributes to the development of a protective Th1 response during Trypanosoma cruzi infection by intrinsic signaling in conventional T cells. Different subtypes of T cells participate in the resistance to Trypanosoma cruzi infection, however, the role of γδ T lymphocytes in this context remains unclear. The aim of our work was to evaluate the phenotype of γδ T cells in acute infection with T.cruzi and study the importance of IL-18 signaling on these cells within the context of this protozoan infection. In order to analyze the γδ T cell profile throughout the infection, C57Bl/6 mice were inoculated intraperitoneally (ip.) with 2 x 10³ blood trypomastigotes of the Y strain of T. cruzi. We observed that splenic γδ T cells expand mainly between 14 and 21 days post infection (dpi). Similarly to the spleen, the kinetics of γδ T cells infiltrate in the heart during T. cruzi infection revealed that the peak occurred around 14 dpi and gradually decreased at 21 dpi. The intracardiac parasitism curve, measured by qPCR, followed the kinetics of γδ T cells infiltrate, indicating a possible role of these cells in control of T. cruzi infection. To evaluate the role of MyD88-dependent signaling pathways in the expansion of γδ T cells, MyD88-/- and C57Bl/6 mice were inoculated intraperitoneally (ip.) with 2 x 10³ blood trypomastigotes of the Y strain of T. cruzi. At 14 dpi, we observed that γδ T cells were significantly reduced in MyD88-/- mice, as compared to WT mice, both in the spleen and in the heart, demonstrating that MyD88-dependent signaling pathways cooperate for the proliferation of this cell population. In order to evaluate the influence of IL-18R signaling pathway on γδ T cells during T. cruzi infection, in vitro experiments were performed with sorted γδ T cells from infected mice. We observed that IL18R-/- γδ T cells expand less and are less activated (CD27 +/GzB+) than WT γδ T cells in culture after stimulation. This phenotype was corroborated by in vivo experiments. At 14 dpi, IL18R-/- mice displayed reduced frequencies of γδ T cells in the spleen and in the heart. In addition, GzB+ and IFN-γ+ γδ T cells were also reduced in the spleen of IL-18R-/- mice as compared to WT. Next, we performed in vitro cytotoxicity experiments with co-cultivated WT or IL-18R-/- γδ T cells and T. cruzi-infected macrophages. We observed that WT cells displayed increased cytotoxicity as compared to IL-18R-/- cells, demonstrating that IL-18R / MyD88 signaling induces a cytotoxic phenotype in γδ T cells during T. cruzi infection. Finally, in order to investigate the protective role of γδ T cells, we performed adoptive transfer of WT γδ T cells to IL-18R-/- susceptible mice. We observed that the transference reverted the mortality and reduced the parasitemia of knockout mice as compared to the nontransferred animals. Our results demonstrate that IL-18R / MyD88 signaling contributes to the expansion and activation of γδ T cells during acute T. cruzi infection. Moreover, these cells seem important to the control of parasitism and modulation of the immune response through IFN-γ production.
Keywords: Trypanosoma cruzi; IL-18; γδ T cells; cytotoxicity; IFN-γ; Th1 immune response
Mecanismos moleculares envolvidos na liberação de redes extracelulares de dna por eosinófilos humanos em resposta ao fungo aspergillus fumigatus.
Título
Título: Mecanismos moleculares envolvidos na liberação de redes extracelulares de dna por eosinófilos humanos em resposta ao fungo aspergillus fumigatus.
Aluno(a): Isabella Gropillo de Carvalho Gomes
Orientador(es): Prof(a). Josiane Sabbadini Neves
Resumo
Eosinófilos são granulócitos classicamente relacionados a doenças alérgicas e a respostas imunes do hospedeiro a helmintos, bactérias e também fungos. A liberação de redes extracelulares de DNA por leucócitos é um mecanismo importante da resposta imune inata a patógenos em diferentes condições infecciosas, incluindo infecções fúngicas. Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) é um fungo oportunista responsável pela aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA), uma doença pulmonar marcada por uma inflamação eosinofílica proeminente. Estudos anteriores de nosso grupo demonstraram que eosinófilos humanos isolados liberam redes extracelulares de DNA (EETs) quando estimulados por A. fumigatus in vitro em um mecanismo dependente de CD11b e Syk tirosina quinase e que envolve a morte da célula, mas independe de espécies reativas de oxigênio. Dentro deste contexto, neste trabalho o objetivo foi dar continuidade aos estudos anteriores e contribuir com a elucidação de outros mecanismos importantes que estariam orquestrando a liberação de EETs em resposta ao A. fumigatus com foco na investigação do papel de diferentes proteínas quinases e da necessidade da viabilidade do fungo para a indução das EETs. Para isso, eosinófilos do sangue de doadores saudáveis foram isolados por seleção imunomagnética negativa e pré-tratados durante 30 minutos com inibidores farmacológicos de diferentes quinases, incluindo PP2 (inibidor da família Src; 10 μM), wortmanin (pan-inibidor de PI3K; 0,1 μM), AS605240 (inibidor de IP3K de classe I; 1 μM), IC-87114 (inibidor de IP3Kδ; 1 μM), SB202190 (inibidor de p38 MAPK; 10 μM) e inibidor de AKT VII (2,6 μM) e depois estimulados com A. fumigatus numa proporção célula:fungo 1:10 por 6h. Observamos que os tratamentos com PP2 ou wortmanin aboliram completamente a liberação de EETs induzida por A. fumigatus. Para confirmar a participação de PI3K de classe I e PI3Kδ neste processo, utilizamos os compostos AS605240 e IC-87114 respectivamente. Tanto o tratamento com o composto AS605240 quanto o IC-87114 sugerem um efeito inibitório, entretanto ainda com ausência de significância estatística. Os resultados também sugerem que p38 MAPK e AKT estão envolvidas na liberação de EET induzida por A. fumigatus, entretanto ainda sem a certeza da significância estatística. De acordo com os experimentos realizados até o momento, nenhum tipo de toxicidade foi verificada para os inibidores utilizados tanto em relação aos eosinófilos, como em relação ao fungo. Os resultados também indicam que a liberação de EETs independe da viabilidade do A. fumigatus. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a liberação de EET induzida por A. fumigatus depende da sinalização da família Src quinase, PI3K e, possivelmente, p38 MAPK e AKT. O mecanismo de liberação de EETs frente ao A. fumigatus parece ser independe da viabilidade do A. fumigatus e provavelmente envolve o reconhecimento de moléculas da parede celular do fungo, e não moléculas secretadas por ele.
Palavras Chave: Eosinófilos; A. fumigatus; redes extracelulares de DNA; aspergilose bronco pulmonar alérgica
Abstract
Eosinophils are granulocytes classically involved in allergic diseases and in the host immune responses to helminths, fungi, bacteria and also virus. The release of extracellular DNA traps by leukocytes is an important mechanism of the innate immune response to pathogens in different infectious conditions, including fungal infections. Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is an opportunistic fungus responsible for the allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA), a pulmonary disease marked by a prominent eosinophilic inflammation. Previously, we demonstrated that isolated human eosinophils release DNA extracellular traps (EETs) when stimulated by A. fumigatus in vitro in a mechanism that involves CD11b and Syk tyrosine kinase, and which involves the death of the cell, but not reactive oxygen species. In this work, our aim was to continue the previous studies and contribute to the elucidation of other mechanisms that orchestrate the release of EETs in response to A. fumigatus with focus on the role of different protein kinases and the need for the fungus viability to induce EET release. To achieve this purpose, we isolated eosinophils from the blood of healthy donors by negative immunomagnetic selection, pretreated for 30 minutes with different pharmacological inhibitors to different kinases including PP2 (10 M; Src family inhibitor), wortmannin (0,1 M; IP3K pan-inhibitor), AS605240 (1 µM; class I IP3K inhibitor), IC-87114 (1 µM; IP3K δ inhibitor), SB202190 (10 M; p38 MAPK inhibitor) and AKT inhibitor VII (2,6 µM), and then stimulated with A. fumigatus in a cell:fungi ratio of 1:10 for 6h. We observed that the treatment with PP2 or wortmannin completely abrogated the A. fumigatus-induced EETs release. To confirm the participation of class I IP3K and IP3Kδ in this process, we used AS605240 and IC87114, respectively. Both treatments with AS605240 or IC-87114 suggest an inhibitory effect, although still lacking statistical significance. The results also suggest that p38 MAPK and AKT are involved in A. fumigatus-induced EETs release, however the statistical significance is not certain. According to the obtained results, no toxicity was observed for the inhibitors used, neither for eosinophils, nor for the fungus. The results also indicate that EETs release is not dependent on the viability of A. fumigatus. In conclusion, our results showed that A. fumigatusinduced EETs release is dependent on the Src family, IP3K signaling and, possibly, p38 MAPK and AKT. The mechanism of A.fumigatus-induced EETs release is not dependent of fungus viability and probably involves recognition of fungus cell wall molecules, but not fungussecreted molecules.
Keywords: Eosinophils; A. fumigatus; extracellular DNA traps; allergic broncho pulmonary aspergillosis
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