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Título

Título: Dois lados de uma mesma moeda: Papel da fibra da dieta no desenvolvimento da peritonite e da sepse

Aluno: Bruno Jennings de Almeida

Orientador(es): Profa. Ana Carolina de Siqueira Couto De Oliveira

Resumo

Introdução: A difteria é uma doença infecciosa aguda do trato respiratório superior causada pelo Corynebacterium diphtheriae (Cdi). Além da infecção clássica, o Cdi é capaz de causar infecções invasivas. Apesar da vacinação, os casos de difteria não se extinguiram e os números globais permanecem estáveis. Surtos da doença acontecem frequentemente, atingindo inclusive indivíduos vacinados, e a mortalidade em geral é alta. O potencial epidêmico de diferentes cepas é desconhecido, o que representa um risco de ressurgência da doença. Desde a formulação da vacina, os estudos de difteria são escassos, principalmente em relação a interação do Cdi com o hospedeiro. Objetivo: Descrever os aspectos gerais da resposta imunitária na infecção in vitro e in vivo em camundongos C57BL/6 pelo Cdi, enfatizando o papel dos receptores TLR2 e TLR4. Metodologia: células RAW, pneumócitos A549 e macrófagos oriundos de medula óssea (BMDMs) murina selvagens (WT), Tlr2 -/- e Tlr4 -/- foram infectados in vitro com as amostras de Cdi 27010 e 27012. Após o estímulo, avaliou-se a capacidade de aderência e internalização bacteriana e sua capacidade de induzir óxido nítrico (NO), arginase e citocinas pró-inflamatórias. Animais WT, Tlr2-/- e Tlr4-/- foram infectados via intranasal ou intraperitoneal com a cepa Cdi 27012. Os animais foram acompanhados ao longo de treze dias e avaliados quanto ao peso, carga bacteriana em diferentes compartimentos, bem como em relação a presença de infiltrado inflamatório. Resultados: O Cdi se mostrou capaz de aderir a macrófagos murinos e de induzir a produção de NO, arginase, TNF-α e IL-6 nestas células. A produção de NO e arginase foi dependente da sinalização pelos receptores TLR2 e TLR4, ao passo que a produção das citocinas foi dependente apenas de TLR2. O Cdi se associou em maior quantidade com BMDMs Tlr4-/- em comparação com WT. O Cdi foi capaz de invadir células da linhagem de pneumócitos A549. Experimentos realizados in vivo mostraram que camundongos WT, Tlr2-/- e Tlr4- /- são resistentes à infecção pulmonar com o Cdi 27012, e pouca ou nenhuma resposta inflamatória foi suscitada. Enquanto que, na infecção intraperitoneal, animais Tlr2-/- e Tlr4-/- apresentaram maior perda de peso. Os animais Tlr4-/- foram os que apresentaram maior carga microbiana no peritônio. Observamos a evidente ativação da resposta imunitária e inflamatória, marcadamente baseada em neutrófilos e macrófagos peritoneais pequenos (SPMs). Os receptores TLR2 e TLR4 parecem ser importantes para a tolerância ao dano, mas não essenciais para a resistência à infecção. Conclusões: o Cdi é capaz de ativar macrófagos, induzindo um perfil pró-inflamatório nestas células, mas apesar disso, também induzindo arginase. Ambos os receptores TLR2 e TLR4 parecem ser importantes para o reconhecimento do bacilo diftérico, e implicam na ativação dos macrófagos. Contudo, a ausência individual deles ocasiona fenótipos distintos in vitro e in vivo. Nossos resultados indicam que neutrófilos e macrófagos talvez sejam as populações celulares mais importantes para o controle da infecção pelo Cdi, e apesar dos receptores TLR2 e TLR4 serem importantes para o recrutamento de células, eles não são essenciais para o controle da infecção.

Palavras-chave: Macrófagos;TLR2 e TLR4;Óxido Nítrico;Arginase.;Difteria

Abstract

Introduction: Diphtheria is an upper respiratory acute infectious disease caused by Corynebacterium diphtheriae (Cdi). Besides classical disease, Cdi is able to cause invasive infections. Despite global immunization, diphtheria is still prevalent. Outbreaks are frequently reported, affecting both vaccinated and non-vaccinated individuals. Mortality rates are customarily high. Infections due to non-toxigenic Cdi and epidemic strains are quite alarming for diphtheria re-emergence. Since vaccine development, studies regarding diphtheria are scarce, especially in relation to the interaction between Cdi and the host. Aim: Describe general aspects regarding the immune response against Cdi infection in vitro and in vivo in C57BL/6 mice, highlighting the role of TLR2 and TLR4. Methods: RAW macrophages, A549 pneumocytes and bone marrow derived macrophages (BMDMs) WT, Tlr2-/- and Tlr4-/-were infected in vitro with Cdi 27010 and 27012. After infection, bacterial adherence and internalization were assessed. The capacity of Cdi to induce nitric oxide (NO), arginase and pro-inflammatory cytokines was also evaluated. Additionally, WT, Tlr2-/- and Tlr4-/-mice were infected with Cdi 27012 either via intranasal or intraperitoneal route. Mice were checked for thirteen days and assessed for body weight changes, bacterial burden in different compartments, and inflammatory cell infiltrate. Results: Cdi was able to adhere to murine macrophage, and induce NO, arginase TNF-α and IL-6 in these cells. NO and arginase production were dependent on TLR2 and TLR4 signalling, whereas cytokine production was only TLR2- dependent. Cdi showed higher association levels with Tlr4-/-BMDMs in compare to wildtype cells. Cdi was able to invade A549 pneumocytes. WT, Tlr2-/- and Tlr4-/-mice were resistant to pulmonary Cdi 27012 infection, displaying little inflammatory response. In contrast, intraperitoneal infection provoked evident immune and inflammatory response, notably due to neutrophil and small peritoneal macrophage (SPM) recruitment. TLR2 and TLR4 seem to be important for damage tolerance, but are essential for resistance to infection. Conclusions: Cdi is able to activate macrophages, inducing a pro-inflammatory profile in these cells, yet inducing arginase as well. Both TLR2 and TLR4 seem to be important for Cdi recognition, which reflects upon macrophage activation. However, TLR2 and TLR4 individual depletion lead to distinct phenotypes in vitro and in vivo. Our results suggest that neutrophils and macrophages might be critical for Cdi control. In spite of TLR2 and TLR4 apparent role for leucocyte recruitment, these receptors are not imperative for disease control.

Keywords: Diphtheria; Macrophage; TLR2 and TLR4; Nitric Oxide; Arginase

Título

Título: Estudo do líquido cefalorraquidiano sobre a quebra da barreira hematoencefálica durante a mielopatia associada à infecção pelo HTLV-1

Aluno: Thais Silva de Oliveira

Orientador(es): Profa. Juliana Echevarria Lima

Resumo

O vírus linfotrópico para células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da Mielopatia Associada à infecção pelo HTLV-1/Paraparesia Espástica Tropical (MAH/PET). O desenvolvimento de MAH/PET depende da quebra da barreira hematoencefálica (BHE) e da migração de leucócitos para a medula espinhal. A BHE mantém o meio interno do cérebro altamente regulado e a sua quebra facilita a entrada de células e patógenos no sistema nervoso central (SNC). O desenvolvimento de MAH/PET envolve o aumento da expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular, citocinas inflamatórias e metaloproteases. A circulação do líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fenômeno dinâmico e sua regulação é responsável pela homeostase cerebral. Alterações neste fluido são prejudiciais à integridade do tecido cerebral. Assim, o objetivo do nosso trabalho foi estudar as interações entre o LCR de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e o endotélio da microvasculatura cerebral. Para tal, usamos uma linhagem celular microvascular de cerebral humana (HBMEC) cultivada na presença LCR de indivíduos infectados com HTLV-1. A presença de mediadores inflamatórios no LCR foi capaz de comprometer a integridade da barreira hematoencefálica. Nossos resultados demonstraram que o LCR de indivíduos infectados pelo HTLV-1 reduziu a resistência elétrica transendotelial (TEER) da monocamada de células HBMEC após 40 horas. Além disso, aumentou sua permeabilidade. Adicionalmente, o aquecimento do LCR reverteu parcialmente a redução da TEER em células HBMEC, o que não foi observado após ultracentrifugação. Essas alterações ocorrem sem comprometimento da viabilidade celular e sugerem que a quebra da barreira hematoencefálica facilita a migração de células inflamatórias. Mostramos, também, que as células tratadas com o LCR de indivíduos infectados, tanto de portadores assintomáticos quanto de pacientes com MAH/PET, são alteradas em comparação com controles de células cultivadas somente na presença de meio. A análise proteômica dessas células demonstrou perfis proteicos distintos, com aumento de proteínas associadas a processos metabólicos, mostrando que o mestabolismo celular é modulado por componentes do LCR. Além disso, demonstramos que importantes proteínas de citoesqueleto e de adesão célula-célula são moduladas nas HBMECs tratadas com o LCR desses pacientes. Além disso, o LCR destes indivíduos estimulou o aumento de propriedades de adesão endotelial, como a expressão aumentada de CD44, o que permitiria uma maior capacidade de ligação de células inflamatórias ao endotélio. Nossos resultados indicaram que a expressão de pan-caderina foi elevada em HBMECs tratadas com o LCR de indivíduos infectados pelo HTLV-1. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a natureza dos fatores envolvidos na desorganização da monocamada de células endoteliais é de origem proteica, e que o LCR de indivíduos infectados por HTLV-1 está envolvido no desenvolvimento e progressão da MAH/ PET.

Palavras-chave: MAH/PET; hBMEC; BHE; LCR; SNC; TEER

Abstract

The human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the etiological agent of the Myelopathy Associated with HTLV-1/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP). The development of HAM/TSP depends on the breakdown of the blood-brain barrier (BBB) and the migration of leukocytes to the spinal cord. BBB maintains the internal brain environment highly regulated, and its breakdown facilitates the entry of cells and pathogens into the central nervous system (CNS). The development of MAH/PET involves increased expression of adhesion molecules by the vascular endothelium, inflammatory cytokines and metalloproteases. The circulation of the cerebrospinal fluid (CSF) is a dynamic phenomenon, and its regulation is responsible for cerebral homeostasis. Changes in this fluid are detrimental to the integrity of the brain tissue. Thus, the objective of this study was to evaluate interactions between CSF obtained from HTLV-1-infected individuals and the endothelium of the cerebral microvasculature. Therefore, we used a human cerebral microvascular cell line (HBMEC) treated with CSF from HTLV-1-infected individuals. The presence of inflammatory mediators in CSF is capable of compromising the integrity of the blood-brain barrier. Our results demonstrated that CSF of HTLV-1-infected individuals reduced the transendothelial electrical resistance (TEER) of HBMEC monolayers after 40 hours of incubation and increased its permeability. Additionally, heating of CSF partially reversed the reduction in TEER of HBMECs, in contrast to ultracentrifugation. These changes occured without impairment of cell viability, which suggests that breakdown of the blood-brain barrier may facilitate the migration of inflammatory cells. We also showed that cells treated with CSF from HTLV-1-infected individuals, asymptomatic carriers as well as patients with MAH/PET, are altered when compared to cells maintained only with culture medium. Using proteomic analysis, we showed that these cells have distinct protein profiles, with increase in proteins associated with metabolic traits, showing that cellular metabolism is modulated by components within the CSF. We also showed that important cytoskeletal and cell-cell adhesion proteins are modulated in these cells when treated with CSF from HTLV-1-infected individuals. In addition, CSF from HTLV-1-infected patients increased the adhesive properties of the endothelium, as shown by the enhanced expression of CD44, which can lead to a greater adhesion capacity of inflammatory cells to the endothelium. Our results indicated that pan-cadherin expression was elevated in HBMEC treated with CSF from HTLV-1-infected individuals. In conclusion, our results suggest that the nature of factors promoting the disorganization of endothelial cell monolayer is of protein origin, and that CSF of HTLV-1-infected individuals is involved in the development and progression of HAM/TSP.

Keywords: HAM/TSP; HTLV-1; hBMECs; Blood-Brain-Barrier; CSF; CNS; TEER

Título

Título: Estratégias de inibição da Glutamina:Frutose-6-fosfato amidotransferase humana (hGFAT)

Aluno: Daniela Maria dos Santos Lucena

Orientador(es): Profa. Adriane Regina Todeschini

Resumo

A via biossintética das hexosaminas (VBH) é um dos ramos do metabolismo da glicose que fornece o monossacarídeo ativado uridina difosfato N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc), um sensor metabólico intracelular essencial para a glicosilação. A primeira etapa da VBH é realizada pela enzima glutamina:frutose-6-fosfato-amidotransferase (GFAT). Esta enzima possui dois domínios: glutaminase e isomerase; que catalisam a formação de glicosamina-6-fosfato (GlcN-6P) a partir da frutose-6-fosfato (Fru-6P) e glutamina (Gln). A GFAT é conservada em todos os organismos estudados até o momento, incluindo bactérias, fungos e mamíferos. Os humanos têm três isoformas diferentes de GFAT, denominadas GFAT1, GFAT1Alt e GFAT2, com GFAT1 tendo expressão ubíqua nos tecidos. A GFAT2, por sua vez, compartilha 75% de identidade com a GFAT1 e é expressa principalmente nos tecidos do sistema nervoso central. O interesse na GFAT aumentou nos últimos anos, uma vez que esta proteína tem sido implicada em importantes desordens metabólicas humanas. No câncer, observou-se que a expressação aumentada de GFAT1 é relatada em câncer da mama e da próstata e que a GFAT2 é regulada positivamente no adenocarcinoma pancreático e no câncer do cólon. Portanto, a GFAT foi identificada como um potencial alvo quimioterápico para o câncer. O inibidor comercial da GFAT é o DON (6-diazo-5-oxo-L-norleucina), um análogo de Gln que se liga irreversivelmente ao sítio glutaminase da enzima. Entretanto, não é utilizado na clínica devido à sua não seletividade e citotoxicidade, sendo restrito ao uso na pesquisa. Portanto, é necessário procurar novos potenciais inibidores da GFAT. Nesse trabalho, estudamos estratégias de inibição da GFAT2 humana (GFAT2h) através de potenciais inibidores seletivos. De modo a realizar um amplo rastreio de potenciais inibidores de GFAT, utilizamos as técnicas de modelagem molecular, como docking e virtual screening, para refinar a seleção de protótipos inibitórios e obter insights para futuro refinamento da estrutura. Os principais compostos resultantes da triagem inicial foram testados e avaliados in vitro frente a sua atividade. Depois de expressar e purificar com sucesso a GFAT2 recombinante humana a partir de células de Escherichia coli, a atividade inibitória de uma série de compostos (LASSBio-1799, 1801, 1802, 1805, 1808, 1809, 1821 e 294), selecionados in silico, contra a enzima recombinante foi avaliada pelo ensaio Elson-Morgan, que detecta a quantidade total de GlcN-6P formada. A partir da série LASSBio testada, apenas o LASSBio-1799 e 1801, mostraram uma ligeira atividade inibitória.

Palavras-chave: GFAT; Via das hexosaminas; Modelagem molecular; Inibidores; Câncer

Abstract

The hexosamine biosynthetic pathway (HBP) is a branche of glucose metabolism that provides the activated monosaccharide uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc), an intracellular metabolic sensor used for glycosylation. The first stage of HBP is performed by the enzyme glutamine:fructose-6-phosphate-amidotransferase (GFAT). This enzyme has two domains, glutaminase and isomerase, which catalyze the formation of glucosamine-6-phosphate (GlcN-6P) from fructose-6-phosphate (Fru-6P) and glutamine (Gln). GFAT is conserved in all organisms studied so far, including bacteria, fungi and mammals. Humans have three different GFAT isoforms, termed GFAT1, GFAT1Alt and GFAT2, with GFAT1 having ubiquitous expression in tissues. GFAT2, in turn, shares 75% identity with GFAT1 and is expressed primarily in central nervous system. Interest in GFAT has increased in recent years, as this protein has been implicated in important human metabolic disorders. In cancer, it has been reported increased GFAT1 expression is in breast and prostate cancer, and upregulated GFAT2 expression is in pancreatic adenocarcinoma and colon cancer. Therefore, GFAT has been identified as a potential chemotherapeutic target for cancer. The commercial GFAT inhibitor is DON (6-diazo-5-oxo-L-norleucine), a Gln analog that irreversibly binds to the glutaminase site of the enzyme. In it is not used in the clinic because of its non-selectivity and cytotoxicity, being restricted to the use in research. Therefore, it is necessary to look for new potential GFAT inhibitors. In this work we studied strategies of human GFAT2 (GFAT2h) inhibition through the selection of potential selective inhibitors. In order to perform an extensive screening for potential GFAT inhibitors, we will use molecular modeling techniques, such as docking and virtual screening, to refine the selection of inhibitory prototypes and gain insights for future refinement of the structure. The main compounds resulting from the initial screening were tested and evaluated in vitro for their inhibitory activity. After successfully expressing and purifying human recombinant GFAT2 from Escherichia coli, the inhibitory activity of a series of compounds (LASSBio 1799, 1801, 1802, 1805, 1808, 1809, 1821 and 294) selected in silico, against the recombinant enzyme was evaluated by the Elson-Morgan assay, which detects the total amount of GlcN-6P formed. From the LASSBio series tested, only LASSBio 1799 and 1801 showed a slight inhibitory activity.

Keywords: GFAT; Hexosamine biosynthetic pathway; Molecular modeling; Inhibitors; Cancer.

Título

Título: Estudo dos efeitos da sinalização MyD88-dependente intrínseca ao linfócito B sobre a diferenciação in vitro e homeostase periférica de células T reguladoras CD4+Foxp3+

Aluno: Carolina Paulino Pacini

Orientador(es): Prof. Fabio Barrozo Canto

Resumo

As células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) são imprescindíveis para o estabelecimento da tolerância periférica. Essa população pode ser originada tanto no timo quanto no ambiente pós-tímico, e estudos recentes revelaram a importância das células Treg periféricas no controle da homeostase intestinal e da auto-tolerância. No compartimento periférico, linfócitos T convencionais CD4+CD25-Foxp3-(Tconv) podem ser induzidos a expressar o fator de transcrição chave do fenótipo supressor, Foxp3, após reconhecimento antigênico específico em presença de IL-2 e TGF-β. A indução pós-tímica de células Treg ocorre preferencialmente no nicho da mucosa intestinal e é significativamente modulada pela microbiota comensal. Apesar da célula dendrítica ser considerada o principal tipo celular envolvido na modulação da homeostase periférica de células Treg, nosso grupo e outros já demonstraram a importância de linfócitos B para geração de Treg no ambiente pós-tímico. No entanto, o papel da estimulação de linfócitos B por componentes microbianos sobre a modulação do compartimento de células Treg permanece obscuro. O objetivo deste trabalho, portanto, foi determinar a influência da sinalização MyD88-dependente nos linfócitos B, em resposta a componentes microbianos conservados evolutivamente, tanto na diferenciação in vitro de células Treg (iTreg) quanto na dinâmica populacional in vivo do compartimento de Treg presente em órgãos linfoides periféricos associados ou não à mucosa intestinal. Para determinar o impacto da sinalização do linfócito B por agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs) sobre a geração de iTreg, células Tconv CD4+CD25-Foxp3-, purificadas de camundongos.C57BL/6 Foxp3gfp por cell sorting, foram co-cultivadas, sob condição polarizante para o fenótipo regulador, com linfócitos B esplênicos isolados de doadores WT, Tlr9-/-, Myd88-/-ou Il6-/-, na presença ou ausência de CpG ou LPS. Nossos resultados demonstraram que o potencial dos linfócitos B em induzir a diferenciação de células T reguladoras in vitro foi inibido pelo CpG e LPS de maneira dependente de MyD88. A produção da citocina IL-6 pelos linfócitos B em resposta ao CpG contribuiu significativamente para a inibição da diferenciação de iTreg. Curiosamente, esta inibição correlacionou-se com níveis reduzidos de expressão de MHC classe II e marcadores de ativação pelos linfócitos B, num processo também mediado pela IL-6. Apesar de seu contato mais frequente com componentes microbianos in vivo, células B provenientes dos linfonodos mesentéricos (BmLN) foram tão competentes em potencializar a geração de iTreg quanto as de origem esplênica. Todavia, as células BmLN privadas do contato com a microbiota in vivo, por meio do tratamento de animais WT com antibióticos, foram mais eficientes na promoção de Treg in vitro. Corroborando com esse dado, foi encontrado um maior número absoluto de células Treg CD4+Foxp3+, decorrente de proliferação aumentada, nos linfonodos mesentéricos do animal deficiente em MyD88 exclusivamente nos linfócitos B (CD19CreMyd88flox/flox). Em comparação com o controle WT, este animal também apresentou números mais baixos de Treg CD25+ no baço e menor proliferação das células Foxp3+ totais nas placas de Peyer. Portanto, demonstramos que (i) a estimulação direta do linfócito B pelos ligantes de TLR CpG e LPS inibe seu potencial pró-Treg in vitro e (ii) a sinalização MyD88 dependente intrínseca ao linfócito B participa na modulação homeostática do compartimento periférico de células Treg. Esses dados contribuem para elucidação do eixo imunorregulatório entre linfócitos B, células T reguladoras e microbiota na fisiologia imunitária.

Palavras-chave: Células T reguladoras; linfócitos B; microbiota; receptores do tipo Toll; imunorregulação; Foxp3; MyD88

Abstract

CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Treg) are essential for the establishment of peripheral tolerance. Treg cells can originate both within the thymus and in the post-thymic compartment, and recent studies have shown the role of peripherally-induced Treg cells (pTreg) on the control of gut homeostasis and self-tolerance. In the peripheral, compartment, conventional CD4+CD25-Foxp3- T lymphocytes (Tconv) can be induced to express the key suppressive transcription factor Foxp3 upon antigen-specific recognition in the presence of IL-2 and TGF-β. The post-thymic Treg cell differentiation occurs mainly in the intestinal mucosa, where it is significantly modulated by commensal microbiota. Although dendritic cells are considered the main cell type involved in the peripheral modulation of Treg cell homeostasis, we and others have already shown the relevance of B lymphocytes to Treg induction in the post-thymic environment. However, the role of B cell-stimulation by microbial components in modulating Treg cell compartment remains unexplored. The aim of the current study, therefore, was to investigate the influence of MyD88-dependent signaling on B lymphocytes, in response to conserved microbial components, on both in vitro-induced Treg (iTreg) cell differentiation and the Treg cell dynamics in vivo in secondary lymphoid organs related or not to the intestinal mucosa. To address the effect of B cell stimulation by Toll-like receptor (TLR) agonists upon iTreg generation, FACS-purified CD4+CD25-Foxp3- Tconv cells, isolated from C57BL/6.Foxp3gfp mice, were co-cultured under iTreg-polarizing conditions with splenic B lymphocytes isolated from either WT, Tlr9-/- , Myd88-/- or Il6-/- donors, in the presence or absence of CpG or LPS. Our results demonstrated that the ability of B cells to promote iTreg was inhibited by CpG and LPS in a MyD88-dependent manner. B cell-derived IL-6 produced in response to CpG contributed significantly for the inhibition of iTreg differentiation. Surprisingly, such inhibitory effect correlated with lower expression of MHC class II and activation markers by B lymphocytes in a process mediated by IL-6. Despite its persistent interaction with microbial components in vivo, B lymphocytes derived from mesenteric lymph nodes (BmLN) were as competent as splenic B cells in driving iTreg generation. Conversely, BmLN lymphocytes became more supportive of iTreg formation when their prior contact with microbiota in vivo was inhibited by antibiotic treatment of WT mice. In accordance with these data, we found higher numbers of CD4+Foxp3+ Treg cells, associated with increased proliferation, within the mesenteric lymph nodes of mice congenitally deficient forMyD88 expression exclusively on B lymphocytes (CD19CreMyd88flox/flox). In comparison to CD19WTMyd88flox/flox control littermates, the CD19CreMyd88flox/flox mice displayed lower levels of CD25+Foxp3+ Treg cells in the spleen and reduced Foxp3+ Treg cell proliferation in the Peyer’s patches. Therefore, we demonstrated here that (i) direct TLR-dependent sensing of CpG and LPS by B cells inhibits their pro-iTreg potential and (ii) the intrinsic B lymphocyte MyD88-signaling plays a role in the modulation of Treg compartment in vivo. Our findings provide new insights to the B lymphocyte-Treg cell-microbiota immunoregulatory axis.

Keywords: regulatory T cells; B lymphocytes; microbiota; Toll-like receptors; immune regulation; Foxp3; MyD88

Título

Título: Dois lados de uma mesma moeda: Papel da fibra da dieta no desenvolvimento da peritonite e da sepse

Aluno: Bruno Jennings de Almeida

Orientador(es): Profa. Ana Carolina de Siqueira Couto De Oliveira

Resumo

Peritonite é uma inflamação da cavidade peritoneal decorrente da invasão deste sítio por microrganismos do trato gastrointestinal, sendo caracterizada por uma resposta inflamatória intensa como um mecanismo de defesa do hospedeiro. Essa infecção pode desencadear diversas complicações, como o surgimento de abscessos intra-abdominais ou, quando não contida, evoluir para a sepse. A sepse é uma doença inflamatória sistêmica frequentemente desencadeada pela presença de bactérias na circulação sanguínea. Ela se apresenta em duas fases: uma fase aguda, em que há uma resposta inflamatória exacerbada com liberação de diversos mediadores que estão diretamente relacionados com a falência de órgãos; e uma fase tardia, caracterizada por um quadro de imunossupressão, que contribui para os comprometimentos tardios como infecções secundárias e tumores. Utilizando um modelo de peritonite induzida pela bactéria comensal Bacteroides fragilis e conteúdo cecal estéril (CCE), nosso grupo mostrou que a fibra proveniente da dieta é capaz de induzir resposta inflamatória através da ativação do inflamassomo NLRP3 e indução de IL-1, atuando como um sinal de perigo fora do intestino. No entanto, seu papel como prebiótico e fonte de metabólitos imunomoduladores, já descrito em outros cenários, não foi explorado neste modelo. Dentre os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) gerados a partir da fermentação da fibra pela microbiota intestinal, o acetato se destaca por sua importante função imunomoduladora através do receptor GPR43 em diversas doenças inflamatórias. Por isso, nesse projeto, pretendemos avaliar dois aspectos relacionados à ingestão da fibra proveniente da dieta: I) o que ela pode representar fora do intestino em um cenário de extravasamento do conteúdo colônico, confirmando os dados prévios do grupo e II) como ela pode influenciar, através da geração de AGCC, nas respostas inflamatórias que caracterizam a peritonite e a sepse. Inicialmente nós confirmamos que a fibra da dieta é, de fato, capaz de ativar caspase-1 e levar a produção de IL-1β em macrófagos, bem como levar ao desenvolvimento de peritonite de uma maneira dependente de IL-1. No que tange à função imunomoduladora de AGCC via GPR43, observamos que animais deficientes neste receptor são mais susceptíveis à peritonite induzida por B. fragilis e à sepse experimental induzida por cecal ligation and puncture (CLP), provavelmente por modular negativamente a resposta inflamatória, incluindo o recrutamento de neutrófilos. No que diz respeito à imunossupressão tardia pós sepse, observamos que há uma menor frequência de células Tregs e células dendríticas tolerogênicas em animais GPR43-/- sobreviventes à sepse. Nossos resultados mostram que a fibra fora do intestino pode representar um sinal de quebra da homeostase e levar a produção de IL-1β. Porém, quando no lúmen intestinal, a fibra gera metabólitos imunomoduladores que parecem ser importantes para atenuar o desenvolvimento de peritonite e sepse. Palavras-chave: peritonite; sepse; fibra; acetato; GPR43; imunomodulação.

Palavras-chave: Peritonite; Sepse; Fibra; Acetato; GPR43; Imunomodulação

Abstract

Peritonitis is an inflammation of the peritoneal cavity resulting from the invasion of this site by microorganisms of the gastrointestinal tract, characterized by an intense inflammatory response as a defense mechanism of the host. This infection can trigger several complications, such as the appearance of intra-abdominal abscesses or, when not contained, progress to sepsis. Sepsis is a systemic inflammatory disease often triggered by the presence of bacteria in the bloodstream. It presents in two phases: an acute phase, in which there is an exacerbated inflammatory response with release of several mediators that are directly related to organ failure; and a late phase characterized by immunosuppression, which contributes to late complications such as secondary infections and tumors. Using a peritonitis model induced by the commensal bacteria Bacteroides fragilis and sterile cecal content (SCC), our group showed that dietary fiber is able to induce an inflammatory response through the activation of NLRP3 inflammasome and induction of IL-1β, acting as a sign of danger out of the gut. However, its role as a prebiotic and source of immunomodulatory metabolites, already described in other scenarios, was not explored in this model. Among the short chain fatty acids (SCFA) generated by fermentation of fiber by intestinal microbiota, acetate is notable for its important immunomodulatory function through the GPR43 receptor in several inflammatory diseases. Therefore, in this project, we intend to evaluate two aspects related to the dietary intake of fiber: I) what it can represent outside the gut in a scenario of extravasation of the colonic content, confirming the previous data of the group and II) how it can influence, through the generation of SCFA, on the inflammatory responses that characterize peritonitis and sepsis. Initially we confirmed that dietary fiber is, in fact, capable of activating caspase-1 and leading to IL-1β secretion in macrophages, as well as leading to the development of peritonitis in an IL-1 dependent manner. Regarding the immunomodulatory function of SCFA through GPR43, we observed that animals deficient in this receptor are more susceptible to B. fragilis-induced peritonitis and to experimental sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP), probably by negatively modulating the inflammatory response, including recruitment of neutrophils. Regarding late post – sepsal immunosuppression, we observed that there is a lower frequency of Treg cells and tolerogenic dendritic cells in GPR43-/- surviving sepsis animals. Our results show that the fiber outside the gut can represent a sign of homeostasis breaking and lead to IL-1β production. However, when in the intestinal lumen, fiber generates immunomodulatory metabolites that appear to be important in attenuating the development of peritonitis and sepsis.

Keywords: Peritonitis; sepsis; fiber; acetate; GPR43; immunomodulation.

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