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DISSERTAÇÕES
A Influência da Eritrofagocitose sobre Macrófagos Associados a Melanomas
Título: A Influência da Eritrofagocitose sobre Macrófagos Associados a Melanomas
Aluno: LUIS BATISTA TAN
Orientador(es): MARCELO TORRES BOZZA
Resumo
Tumores sólidos possuem vasculatura defeituosa, permitindo o extravasamento de componentes sanguíneos ou a ocorrência de hemorragias que tem o potencial de afetar o funcionamento das células no microambiente tumoral. Macrófagos associados a tumor (TAM) são células com a capacidade de alterar seu fenótipo em resposta a sinais de ativação, chamada plasticidade funcional, que refletem as condições do seu ambiente. Dependendo do seu estado de ativação, TAMs podem participar da imunidade antitumoral ou auxiliar na progressão do tumor. Hemácias são as células mais abundantes do sangue e são ricas em hemoglobina, proteína contendo o grupamento heme, um padrão molecular associado a dano com diferentes propriedades de ativação celular. Acreditamos que TAMs realizam a eritrofagocitose de forma crônica, sofrendo alterações fenotípicas e assumindo um papel importante na progressão da doença. Assim, tivemos o objetivo de identificar e caracterizar esta população de células no tumor. Em modelo de melanoma murino vimos por citometria de fluxo, que hemácias são fagocitadas por TAMs hipóxicos com alta expressão de CD206 e CD38 in vivo. Em modelo de co-cultura de macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) com células tumorais, a eritrofagocitose induziu a expressão gênica do fator de transcrição Spic, e proteica de Nrf2 e Egr2 além da enzima heme-oxigenase-1. Estes fatores estão associados com a função prótumoral de macrófagos, no entanto BMDMs eritrofagocíticos inibiram o crescimento tumoral quando co-injetados com células de melanoma B16/F10 no flanco de camundongos. Tanto in vitro como in vivo TAMs eritrofagocíticos apresentam marcadores de macrófagos alternativamente ativados, pró-tumorais, como CD206, porém BMDMs eritrofagocíticos atenuaram o crescimento tumoral. Isso sugere que fatores derivados do tumor são importantes para a polarização alternativa de macrófagos por hemácias, no entanto mais estudos são necessários para definir o papel de TAMs eritrofagocíticos na doença. Em conclusão, a eritrofagocitose induz alterações fenotípicas em TAMs, porém o papel destas células na progressão tumoral ainda há de ser determinado. Palavras-Chave: macrófagos; microambiente tumoral; hemorragias; hemácias; melanoma.
Abstract
Solid tumors present a defective vasculature that allows the extravasation of blood components, or the occurrence of hemorrhages that have the potential to affect the function of cells in the tumor microenvironment. Tumor-associated macrophages (TAM) are cells capable of switching their phenotype in response to activation cues, dubbed functional plasticity, reflecting the conditions of their environment. Depending on their activation state, TAMs can either participate in antitumoral immunity or help in tumor progression. Red blood cells are the most abundant cell population in the blood and are rich in hemoglobin, a heme-containing protein. Heme is a damage associated molecular pattern with different cell activating properties. We believe that TAMs chronically perform erythrophagocytosis, which affects their phenotype, and these cells have an important role in tumor progression. Thus, our objective was to identify and characterize this population of cells within the tumor. In the model of B16/F10 murine melanoma, we found that red blood cells are phagocytosed by hypoxic TAMs with high expression of CD206 and CD38, as seen by flow cytometry. Moreover, in a co-culture model of bone marrow derived macrophages (BMDM) with B16/F10 melanoma cells erythrophagocytosis induces gene expression of the transcription factor Spic and protein expression of Egr2 and Nrf2, as well as the enzyme heme oxygenase 1. These factors are associated with tumor-promoting macrophages, however erythrophagocytic BMDMs inhibit tumor growth when co-injected with melanoma cells in the flank of mice. Thus, both in vitro and in vivo erythrophagocytic TAMs present markers of alternatively activated, pro-tumoral macrophages, such as CD206, but erythrophagocytic BMDMs inhibit tumor growth. This suggests that tumor derived factors are important for the alternative polarization of macrophages by red blood cells, yet more studies are necessary to define the role of erythrophagocytic TAMs in disease. In conclusion, erythrophagocytosis induces phenotypic changes in TAMs, but the role of these cells in tumor progression is yet to be determined. Keywords: macrophages; tumor microenvironment; hemorrhages; red blood cells; melanoma.
Keywords:
macrophages;tumor microenvironment;hemorrhages;red blood cells;melanoma
Análise do Disparo da Via Autofágica por Duas Cepas de SARS-CoV-2 Isoladas no Rio de Janeiro
Título: Análise do Disparo da Via Autofágica por Duas Cepas de SARS-CoV-2 Isoladas no Rio de Janeiro
Aluno: JHONES SOUSA RIBEIRO
Orientador(es): LEONARDO HOLANDA TRAVASSOS CORREA
Resumo
A autofagia é um processo catabólico e homeostático que direciona cargas sequestradas, sejam macromoléculas ou patógenos intracelulares, para degradação lisossomal. Este fenômeno é desencadeado por diversos estressores, como a privação nutricional e o aumento dos níveis de AMP, que, por sua vez, inibem a via de mTOR e ativam AMPK, respectivamente. Este processo é finamente regulado por complexos que atuam em etapas específicas, incluindo a formação do autofagossomo, uma estrutura de membrana dupla que envolve a carga sequestrada antes da fusão com o lisossomo. A autofagia pode ser direcionada para a degradação de partículas virais e seus componentes, em um processo conhecido como virofagia. Entretanto, alguns vírus conseguem subverter a autofagia, favorecendo sua replicação e o estabelecimento da infecção. Apesar de algumas pesquisas indicarem diferenças na secreção de citocinas, recrutamento de células do sistema imune e tropismo expandido por alguns órgãos entre diferentes variantes do SARS-CoV-2, pouco se sabe em relação ao disparo da via autofágica. No presente estudo as cepas RJ1, semelhante a cepa originária de Wuhan, e a RJ2, com alterações na proteína S, foram isoladas por pesquisadores do Instituto de Microbiologia Paulo Goés da Universidade Federal do Rio de Janeiro, e utilizadas para infectar células HEK293T e A549, a fim de investigar suas disparidades na replicação viral e indução da via autofágica. Ao empregar diversas abordagens metodológicas, notamos que a cepa RJ1 apresenta uma replicação mais eficaz em comparação com a cepa RJ2. Além disso, observamos uma tendência da cepa RJ2 ter menores níveis de LC3-II, possivelmente associado a alteração na proteína S específica dessa cepa. Nossas descobertas são de extrema relevância, uma vez que a literatura acerca deste tópico ainda é bastante escassa e com resultados bastante contraditórios e podem contribuir com conhecimentos básicos necessários ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento da doença.
Palavras-chave:
SARS-CoV-2;autofagia;cepas virais;LC3-II
Abstract
Autophagy is a catabolic and homeostatic process that directs sequestered cargo, whether macromolecules or intracellular pathogens, for lysosomal degradation. This phenomenon is triggered by several stressors, such as nutritional deprivation and increased AMP levels, which, in turn, inhibit the mTOR pathway and activate AMPK, respectively. This process is finely regulated by complexes that act at specific steps, including the formation of the autophagosome, a double-membrane structure that encloses sequestered cargo before fusion with the lysosome. Autophagy can be directed towards the degradation of viral particles and their components, in a process known as virophagy. However, some viruses manage to subvert autophagy, favoring their replication and the establishment of infection. Although some research indicates differences in the secretion of cytokines, recruitment of immune system cells, and expanded tropism for some organs between different variants of SARS-CoV-2, little is known regarding the triggering of the autophagic pathway. In the present study, strains RJ1, similar to the strain originating in Wuhan, and RJ2, with changes in the S protein, were isolated by researchers from the Paulo Goés Institute of Microbiology at the Federal University of Rio de Janeiro, and used to infect HEK293T and A549 cells to investigate their disparities in viral replication and induction of the autophagic pathway. Employing various methodological approaches, we observed that the RJ1 strain demonstrates more efficient replication compared to the RJ2 strain. Additionally, we observed a tendency for the RJ2 strain to have lower levels of LC3-II, possibly associated with a specific change in the S protein of this strain. Our findings are extremely relevant, since the literature on this topic is still quite scarce and with very contradictory results and can contribute with the basic knowledge necessary for the development of new therapeutic approaches for the treatment of the disease.
Keywords:
SARS-CoV-2,;autophagy,;viral strains,;LC3-II
Avaliação do Papel de Vias de Metabolismo Lipídico na Ativação de Células Dendríticas Infectadas por M. bovis BCG
Título: Avaliação do Papel de Vias de Metabolismo Lipídico na Ativação de Células Dendríticas Infectadas por M. bovis BCG
Aluno: GUILHERME IACK PINHEIRO DA CRUZ
Orientador(es): GUILH PATRICIA TORRES BOZZA VIOLA
Resumo
IACK, Guilherme. Avaliação de vias de metabolismo lipídico na ativação de células dendríticas infectadas por Mycobacterium bovis BCG, Rio de Janeiro, 2023. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Inflamação), Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. A tuberculose (TB) é uma das principais causas de morte no mundo, e o Brasil está entre os países que concentram a maior parte dos diagnósticos. Os tratamentos disponíveis têm encontrado dificuldades devido ao aumento da resistência a antibióticos. Sendo assim, a TB é uma grave questão de saúde pública. O agente causador dessa doença é o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que nos alvéolos infecta principalmente macrófagos e células dendríticas (DCs). Estas células são conduzidas a um processo de morte necrótica, gerando uma inflamação granulomatosa. Esse patógeno pode alterar vias metabólicas do hospedeiro como mecanismo de sobrevivência. Dentre essas vias, o metabolismo lipídico é um importante alvo do patógeno, uma vez que esses interagem com os corpúsculos lipídicos (CLs), possibilitando sua persistência. Neste trabalho observamos o acúmulo de CLs e a proliferação de Mtb H37Rv e M. bovis BCG em DCs derivadas da medula óssea (BMDC)s de camundongos C57BL/6. Esse processo desencadeou a ativação celular e resposta inflamatória, além de modulação do metabolismo lipídico. A infecção por BCG provocou um acúmulo de triacilglicerol e colesterol éster. Sendo assim, avaliou-se o papel desses diferentes lipídios na ativação de BMDCs infectadas por BCG. A inibição farmacológica das enzimas DGAT-1 e 2 promoveu redução da área de CLs e carga bacteriana, além de diminuir a liberação das citocinas IL-1β, IL-10, TNFα e o mediador lipídico PGE2 e a expressão de MHC II. A inibição da enzima ACAT aumentou a carga bacteriana e não alterou a área de CLs, embora tenha aumentado a expressão de CD36. Além disso, o tratamento reduziu a secreção de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α e PGE2, além de diminuir a expressão de MHC I, MHC II e de cox2. Dessa forma, estes resultados demonstram a relevância dos CLs e do metabolismo lipídico na ativação e resposta inflamatória de DCs infectadas por M. bovis BCG, auxiliando a elucidar o papel do metabolismo lipídico na fisiopatologia da TB e apontando-o como potencial alvo terapêutico contra doenças associadas à Mycobacterium sp. Palavras-chave: tuberculose; célula dendrítica; metabolismo lipídico; corpúsculos lipídicos; inflamação; micobactéria
Abstract
IACK, Guilherme. Avaliação de vias de metabolismo lipídico na ativação de células dendríticas infectadas por Mycobacterium bovis BCG, Rio de Janeiro, 2023. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Inflamação), Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. Tuberculosis (TB) is a leading cause of death worldwide, and Brazil is one of the countries with the highest diagnosis rates. The available treatments are facing difficulties due to increased antibiotic resistance. Thus, TB is a critical public health issue. This disease is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), which penetrates the alveoli, infecting mainly macrophages and dendritic cells (DCs). These cells undergo a necrotic death process, generating granulomatous inflammation. This pathogen can alter host metabolic pathways as a survival mechanism. Among these pathways, lipid metabolism is a lead target of the pathogen, via bacteria interaction with host lipid droplets (LDs) which enables its persistence. Herein, we observed the accumulation of LDs and replication of Mtb H37Rv and M. bovis BCG in bone marrow-derived DCs (BMDCs) of C57BL/6 mice. This process triggered cell activation and inflammatory response, in addition to modulation of lipid metabolism. BCG infection induced an accumulation of triacylglycerol and cholesterol ester. Therefore, the role of these different lipids in the activation of BCG-infected BMDCs was evaluated. The pharmacological inhibition of DGAT-1 and 2 enzymes promoted a reduction of the area of LDs and bacterial load, in addition to decreasing the release of cytokines IL-1β, IL-10, TNF-α, and the lipid mediator PGE2 and the expression of MHC II. The ACAT enzyme inhibitor increased the bacterial load and did not change the area of LDs, although it increased the expression of CD36. In addition,the treatment also reduced IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α, and the PGE2, in addition to decreasing the expression of MHC I, MHC II and cox2. Therefore, these results demonstrate the relevance of LDs and lipid metabolism in DCs activation and the response of DCs to M. bovis BCG infection, allowing a better comprehension of the role of lipid metabolism in the pathophysiology of TB and suggesting it as a potential therapeutic target against Mycobacterium sp. associated diseases. Keywords: tuberculosis; dendritic cells; lipid metabolism; lipid droplets; inflammation; micobacteria
Keywords:
tuberculosis;dendritic cells;lipid metabolism;lipid droplets;inflammation;micobacteria
Estudo da Interação do SARS-CoV-2 com Mastócitos: Papel das Redes Extracelulares de DNA (DETS)
Título: Estudo da Interação do SARS-CoV-2 com Mastócitos: Papel das Redes Extracelulares de DNA (DETS)
Aluno: BRUNA CARLOS DO NASCIMENTO BARBOSA
Orientador(es): ELVIRA MARIA SARAIVA
Resumo
Nascimento-Carlos, Bruna. Estudo da interação do SARS-CoV-2 com mastócitos: papel das redes extracelulares de DNA (DETs). Rio de Janeiro, 2023. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Inflamação) – Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023 A doença do coronavírus 2019 (COVID-19) causada pelo vírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) é uma doença infecciosa que causou uma pandemia que se originou na China. A COVID-19 causa doença leve a grave com alta morbidade e mortalidade. Os mastócitos estão estrategicamente localizados em tecidos que fazem a interface com o ambiente externo, como pele, mucosa do trato respiratório e gastrointestinal e podem regular de forma benéfica ou prejudicial as inflamações. Os mastócitos possuem também diferentes atividades microbicidas como fagocitose e liberação de DNA com proteínas granulares incorporadas, conhecidas como redes extracelulares de DNA (DETs). Já foi demonstrado que os neutrófilos liberam redes extracelulares de DNA (NETs) quando estimulados com SARS-CoV-2 e estas estão presentes no plasma e no aspirado traqueal de pacientes com COVID-19. NETs participam da patologia da COVID por sua toxicidade para células epiteliais pulmonares e formação de trombos. Neste trabalho, mostramos que SARS-CoV-2 induz DETs em mastócitos humanos (HMC-1) e, com o uso de inibidores farmacológicos, evidenciamos a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs), de cálcio, da peptidil arginina deiminase e da triptase nesse processo. Sobrenadantes ricos em DETs se mostraram tóxicos para células epiteliais pulmonares e endoteliais, estando as histonas e a triptase envolvidas nessa citotoxicidade. As DETs também se mostraram pró-coagulantes e sua capacidade de induzir a coagulação é maior do que a das NETs. Em conjunto, nossos resultados fornecem uma melhor compreensão de como os mastócitos podem estar envolvidos na fisiopatologia da COVID-19, uma vez que essas DETs são lesivas para células epiteliais pulmonares e células endoteliais e possuem grande capacidade pró-coagulante. Palavras-Chaves: Mastócitos; SARS-CoV-2; COVID-19; Redes extracelulares de DNA; citotoxicidade; pró-coagulantes
Palavras-chave:
Mastócitos;SARS-CoV-2;COVID-19;Redes extracelulares de DNA;citotoxicidade;pró-coagulantes
Abstract
Nascimento-Carlos, Bruna. Study of the interaction of SARS-CoV-2 with mast cells: role of extracellular DNA networks (DETs). Rio de Janeiro, 2023. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Inflamação) – Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023 Coronavirus disease 2019 (COVID-19), caused by severe acute respiratory syndrome virus 2 (SARS-CoV-2), is an infectious disease that caused a pandemic originated in China. COVID-19 causes mild to severe illness with high morbidity and mortality. Mast cells are strategically located in tissues that interface with the external environment, such as the skin and mucosas of the respiratory and gastrointestinal tracts, and can beneficially or detrimentally regulate inflammation. Mast cells have different microbicidal activities such as phagocytosis, degranulation, and release of DNA with incorporated granular proteins, known as extracellular DNA traps (DETs). Neutrophils have already been shown to release traps of extracellular DNA (NETs) when stimulated with SARS-CoV-2, and these are present in plasma and tracheal aspirate from patients with COVID-19. NETs participate in the pathology of COVID by their toxicity to pulmonary epithelial cells and thrombus formation. In this work, we showed that SARS-CoV-2 induces DETs in human mast cells (HMC-1) and, with the use of pharmacological inhibitors, we evidenced the participation of reactive oxygen species (ROS), calcium, peptidyl arginine deiminase (PAD) and tryptase in this process. Supernatants rich in DETs were toxic to pulmonary epithelial and endothelial cells, with histones and tryptase involved in this cytotoxicity. DETs have also been shown to be procoagulants, and their coagulation capacity is greater than that of NETs. Together, our results provide a better understanding of how mast cells may be involved in the pathophysiology of COVID-19 since these DETs are harmful to pulmonary epithelial and endothelial cells and have an important procoagulant capacity. Keywords: Mast cell; SARS-CoV-2; COVID-19; DNA extracellular Traps (DETs); Cytotoxicity; procoagulants
Keywords:
Mast cell;SARS-CoV-2;COVID-19;DNA extracellular Traps (DETs);Cytotoxicity;procoagulants
Estudo dos Efeitos de Sidnonas e Chalconas-Tiossemicarbazonas sobre Células Infectadas pelo HTLV-1
Título: Estudo dos Efeitos de Sidnonas e Chalconas-Tiossemicarbazonas sobre Células Infectadas pelo HTLV-1
Aluno: MARIA CLARA SALGADO CAMPOS
Orientador(es): JULIANA ECHEVARRIA NEVES DE LIMA
Resumo
Estudos sugerem que a infecção pelo vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) afeta milhões de indivíduos no mundo todo, sendo o Brasil um dos países onde a infecção é endêmica. Sabe-se que o vírus é responsável por uma neoplasia altamente agressiva chamada leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL). Foi realizada análise de dados epidemiológicos neste trabalho a partir do Painel de Monitoramento da Mortalidade CID-10 (Classificação Internacional de Doenças-10) do Ministério da Saúde do Brasil entre os anos de 2010 e 2022, utilizando o código C91.5. Nela demonstramos que as regiões com maiores ocorrências de óbitos relacionados a ATL são as regiões Nordeste e Sudeste, corroborando com os dados que demonstram que estas possuem maior prevalência da infecção pelo HTLV-1.Nossos dados reforçam os perfis epidemiológicos encontrados no Brasil e a importância de novos dados atualizados para o desenvolvimento de estratégias para controlar e prevenir a infecção do HTLV-1. Portadores de ATL possuem um mau prognóstico, baixa expectativa de vida, e as células infectadas são resistentes à maior parte dos agentes indutores de apoptose. Assim, ainda existe a necessidade de desenvolver novas terapias mais eficazes e investigar novos compostos com atividades contra células infectadas. Devido à sua grande capacidade e diversidade de atividades biológicas, compostos derivados de sidnonas e de chalconastiossemicarbazonas apresentam aspectos promissores para esta finalidade. Inicialmente, os compostos foram analisados in silico, visando prever atividade biológica (antitumoral e antiviral) e toxicidade. As análises resultram na previsão de efeitos dos compostos em diferentes células cancerígenas, como células de leucemia, com baixa probabilidade de apresentar toxicidade para células não tumorais. A análise também resultou na probabilidade da existência de atividade antiviral contra diferentes vírus, como o vírus da Dengue e Vaccinia, sendo que 2 sidnonas e 2 chalconas-tiossemicarbazonas podem demonstrar atividade antiviral contra o HIV. As análises de toxicidade hepática e genômica, desregulação endócrina e de biodisponibilidade sugeriram que a maioria dos compostos apresenta baixa toxicidade com capacidade de absorção e distribuição. Corroborando esses resultados o ensaio de toxicidade de Artemia salina demonstrou que o tratamento com os compostos não afetou a sobrevivência de artêmias, com exceção das sidnonas S3 e S4. Os resultados in vitro indicam que, de maneira geral, as sidnonas não apresentam citotoxicidade contra células Jurkat e MT-2. Entretanto, as chalconastiossemicarbazonas têm efeitos promissores na morte das células Jurkat (CTCl IC50=35.38µM; CTCl-Zn IC50=26.86µM) e células MT-2 (CTCl IC50=35.81µM; CTCl-Zn IC50=24.91µM). Além de afetar a viabilidade celular, os resultados indicam que as chalconastiossemicarbazonas são capazes de interagir com o DNA, levam ao aumento na proporção de células MT-2 apoptóticas, induzem a ativação de caspases -3 e -7, diminuição da expressão de CD25 e redução de aglomerados celulares. Nossos resultados sugerem que os mecanismos de ação desses compostos envolvem a regulação da proliferação celular e ativação de caspases. Além disso, a terapia combinada de tunicamicina e chalconas-tiossemicarbazonas mostrou efeitos promissores na viabilidade de células MT-2 infectadas, apresentando um potencial terapêutico no futuro. Palavras-chave: HTLV-1; ATL; sidnonas; chalconas-tiossemicarbazonas; morte celular; apoptose; proliferação celular.
Abstract
Studies estimate that human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) infection affects millions of individuals worldwide, with Brazil being one of the countries where the infection is endemic. The virus is known to be responsible for a highly aggressive disease called adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL). Analysis of epidemiological data was carried out in this work from the Mortality Monitoring Panel CID-10 (International Classification of Diseases-10) of the Ministry of Health of Brazil between the years 2010 and 2022, using the code C91.5. We demonstrate that the regions with the highest occurrence of deaths related to ATL are the Northeast and Southeast regions, corroborating the data that demonstrate that these have a higher prevalence of HTLV-1 infection. Our data reinforce the epidemiological profiles found in Brazil and the importance of new updated data for the development of strategies to control and prevent HTLV-1 infection. ATL carriers have a poor prognosis, low life expectancy, and infected cells are resistant to most apoptosis-inducing agents. Thus, the development of new and more effective therapies and compounds with activities against infected cells is very important. Due to their great capacity and diversity of biological activities, compounds derived from sydnones and chalcones-thiosemicarbazones show promising aspects for this purpose. Initially, the compounds were analyzed in silico, aiming to predict biological activity (antitumor and antiviral) and toxicity. The analyzes resulted in the predictiong of compounds effects on different cancer cells, such as leukemia cells, with a low probability of presenting toxicity to non-tumor cells. The analysis also resulted in the likelihood of antiviral activity against different viruses, such as Dengue and Vaccinia viruses, with 2 sydnones and 2 chalcone-thiosemicarbazones showing antiviral activity against HIV. Analyzes of hepatic and genomic toxicity, endocrine disruption, and bioavailability suggested that most compounds have low toxicity with absorption and distribution capacity. The Artemia salina toxicity assay demonstrated that treatment with the compounds did not affect the survival of brine shrimp, except for sydnones S3 and S4. Our in vitro results indicate that, in general, sydnones do not show cytotoxicity against Jurkat and MT-2. However, chalcones-thiosemicarbazones have promising effects on the survival of Jurkat cells (CTCl IC50=35.38µM; CTCl-Zn IC50=26.86µM) and MT-2 cells (CTCl IC50=35.81µM; CTCl-Zn IC50=24.91µM). In addition, the results indicate that chalcones-thiosemicarbazones are capable to trigger its effects by DNA interaction, increase the proportion of apoptotic MT-2 cells, caspases -3 and -7 activation, decrease the expression of CD25 and reduce cell clusters. Suggesting that the mechanisms of action of these compounds involve the regulation of cell proliferation and activation of caspases. Furthermore, the combined therapy of tunicamycin and chalconesthiosemicarbazones showed promising effects on the viability of infected MT-2 cells, presenting a therapeutic potential in the future. Keywords: HTLV-1; ATL; sydnones; chalcones-thiosemicarbazones; cell death; apoptosis; cell proliferation.
Keywords:
HTLV-1;ATL;sydnones;chalcones-thiosemicarbazones;cell death;apoptosis;cell proliferation.
Estudo Longitudinal das Alterações do Metaboloma da Saliva Entre a Fase Aguda e Fase Pós-Aguda da Covid-19 por ¹H Ressonância Magnética Nuclear
Título: Estudo Longitudinal das Alterações do Metaboloma da Saliva Entre a Fase Aguda e Fase Pós-Aguda da Covid-19 por ¹H Ressonância Magnética Nuclear
Aluno: LUIZA TOME MENDES
Orientador(es): IRANAIA ASSUNCAO MIRANDA
Resumo
MENDES, Luiza Tomé. Estudo longitudinal das alterações do metaboloma da saliva entre a fase aguda e pós-aguda da COVID-19 por ¹H Ressonância Magnética Nuclear. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Inflamação), Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. A COVID-19, doença causada pela infecção do vírus SARS-CoV-2, pode variar de um resfriado comum à síndrome respiratória aguda grave, principalmente em indivíduos com condições pré-existentes, como comorbidades. Além disso, muitos sujeitos desenvolvem sintomas que prolongam após a fase aguda da doença. Alterações imunes e metabólicas estão envolvidas com diferentes desfechos clínicos, sendo necessários estudos multissistêmicos para entender a fisiopatologia complexa da COVID-19. Nossa hipótese é que os metabólitos e as vias metabólicas afetadas durante a fase inicial da COVID-19 e a pós-aguda da COVID-19 podem servir como marcadores prognósticos relevantes, auxiliando na compreensão da patogênese e na busca de alvos terapêuticos. Com isso, buscamos identificar marcadores metabólicos entre a fase aguda e fase pós-aguda da COVID-19, independente da manutenção dos sintomas, através da metabolômica por Ressonância Magnética Nuclear de ¹H, na saliva de indivíduos adultos. Os voluntários do estudo foram submetidos ao teste rápido de antígeno no momento da coleta, seguido pela confirmação por RT-PCR. Amostras de saliva foram coletadas de indivíduos sintomáticos infectados por SARS-CoV-2 (COVID) e indivíduos negativos com sintomas respiratórios inespecíficos (SRI). A coorte consistiu em 119 voluntários incluídos na fase aguda (T1): COVID (n=63) e SRI (n=56) e 52 voluntários na fase pós-aguda, 45 dias após o primeiro teste (T2): COVID (n=32) e SRI (n=20). Para a análise, comparamos a variação dos metabólitos entre T1 e T2 de cada grupo. No grupo COVID, a comparação T2 vs T1 indicou aumento dos aminoácidos de cadeia ramificada -isoleucina e leucina, glicose, fumarato, βhidroxibutirato, metabólitos relacionados à colina (fosfatidilcolina, glicerofosfocolina) e taurina, e redução nos níveis de acetato, creatina/creatinina, putrescina + lisina, fenilalanina e histidina. Essas diferenças refletem alterações no metabolismo de glicose, ciclo de Krebs, lipídios, aminoácidos e poliaminas e associadas a processos inflamatórios, danos aos tecidos e órgãos ou reequilíbrio metabólico. Essas alterações não foram observadas no grupo SRI. O grupo SRI, apresentou redução nos níveis de lactato em T2 em relação a T1, a qual pode estar associada a redução do processo inflamatório agudo. Curiosamente, os níveis desse metabólito não variaram entre T1 e T2 no grupo COVID. A flutuação dos metabólitos entre a fase aguda e fase pós-aguda do grupo COVID não parece estar associada a parâmetros como sexo e idade. No entanto, observamos diferenças em indivíduos com sobrepeso/obesidade ou estratificando a coorte com parâmetros como carga viral, tempo de positividade na PCR e intensidade dos sintomas. Além disso, como a coleta da amostra foi realizada no período de transição da implementação da vacina no país, foi possível a estratificação dos grupos entre vacinados e não-vacinados. Observamos que o aumento de fumarato, colina e taurina, bem como a redução de creatina/creatinina e outros aminoácidos, foi significativa somente no grupo não vacinado. Assim, nosso estudo conseguiu descrever uma assinatura metabólica específica da transição entre a fase aguda e fase pós-aguda da COVID-19. Além disso, as diferenças metabólicas associadas a parâmetros clínicos e demográficos podem nos ajudar a compreender a importância desses metabólitos na evolução clínica e previsão de desfechos e outras complicações na progressão da COVID-19. Palavras-chave: COVID-19; Metabolômica; Ressonância Magnética Nuclear; Saliva; Inflamação
Abstract
COVID-19, a disease caused by infection with the SARS-CoV-2 virus, can range from the common cold to severe acute respiratory syndrome, especially in subjects with pre-existing conditions such as comorbidities. Furthermore, many subjects develop prolonged symptoms after COVID. Immune and metabolic changes are involved with different clinical outcomes, requiring multisystem studies to understand the complex pathophysiology of COVID-19. Our hypothesis is that the metabolites and metabolic pathways affected during the acute phase of COVID-19 and the post-acute COVID-19 phase can serve as relevant prognostic markers, helping to understand the pathogenesis and search for therapeutic targets. We searched for metabolic markers between the acute and post-acute COVID-19 phases, irrespective of the symptoms, by ¹H Nuclear Magnetic Resonance metabolomics in the saliva of adult subjects. The study subjects were submitted to the rapid antigen test at the time of collection, followed by confirmation by RT-PCR. Saliva samples were collected from symptomatic donors infected with SARS-CoV-2 (COVID) and negative donors with nonspecific respiratory symptoms (SRI). The cohort consisted of 119 volunteers included in the acute phase (T1): COVID (n=63) and SRI (n=56) and 52 volunteers in the post-acute phase, 45 days after the first test (T2): COVID (n=32) and SRI (n=20). For the analysis, we compared the variation of metabolites between T1 and T2 of each group. In the COVID group, comparing T2 vs T1 it was observed an increase in branched-chain amino acids – isoleucine and leucine, glucose, fumarate, βhydroxybutyrate, choline-related metabolites (phosphatidylcholine, glycerophosphocholine) and taurine, and a reduction in acetate, creatine/creatinine, putrescine + lysine, phenylalanine and histidine levels. These metabolites are involved in the metabolism of glucose, the Krebs cycle, lipids, amino acids and polyamines and associated with inflammatory processes, damage to tissues and organs or rebalancing metabolic. These changes were not observed in the SRI group. The SRI group showed a reduction in lactate levels in T2 compared to T1, which may be associated with a reduction in the acute inflammatory process. Curiously, the levels of this metabolite didn’t vary between T1 and T2 in the COVID group. The fluctuation of metabolites between the acute phase and post-acute COVID-19 phase doesn’t seem to being associated with parameters such as sex and age. However, we observed differences in overweight/obesity subjects, or stratifying the cohort with parameters such as viral load, time of positivity in PCR and intensity of symptoms. Furthermore, since the sample collection was performed at the transition period of vaccine implementation in the country, we had the opportunity to stratify the cohort between vaccinated and non-vaccinated. It was possible to observe that the increase in fumarate, choline and taurine, as well as the reduction in creatine/creatinine and other amino acids, was significant only in the non-vaccinated group. Thus, our study was able to describe a specific metabolic signature of the transition between the acute and post-acute COVID-19 phase. Furthermore, metabolic differences associated with clinical and demographic parameters may help us to understand the importance of these metabolites in clinical evolution and prediction of outcomes and other complications in the progression of COVID-19. Keywords: COVID-19; Metabolomics; Nuclear Magnetic Resonance; Saliva; Inflammation
Keywords:
COVID-19;Metabolomics;Nuclear Magnetic Resonance;Saliva;Inflammation
Liberação de Redes Extracelulares de DNA por Eosinófilos Humanos em Resposta a Fungos Causadores de Micoses Broncopulmonares Alérgicas
Título: Liberação de Redes Extracelulares de DNA por Eosinófilos Humanos em Resposta a Fungos Causadores de Micoses Broncopulmonares Alérgicas
Aluno: CLAUDIA REGINA ISAIAS VASCONCELOS
Orientador(es): JOSIANE SABBADINI NEVES
Resumo
As micoses broncopulmonares alérgicas (MBPAs) constituem um grupo de doenças eosinofílicas causadas pela hipersensibilidade a fungos filamentosos que acometem especialmente adultos asmáticos ou crianças com fibrose cística. A liberação de redes extracelulares de DNA pelos eosinófilos humanos (EETs) contribui para a obstrução das vias aéreas através do aumento da viscosidade das secreções e da interação com células epiteliais e neuroendócrinas, levando ao agravamento dessas patologias. Em trabalhos anteriores mostramos que os eosinófilos humanos liberam EETs em resposta ao Aspergillus fumigatus, a principal espécie de fungo causadora de MBPAs, e que esse processo ocorre de forma independente de espécies reativas de oxigênio e do reconhecimento do fungo por dectina-1, mas dependente da cadeia αM (CD11b) de integrina, de íons cálcio e das quinases Src, Syk, p38 MAPK, PI3Kδ e AKT. Aqui investigamos a participação de outros componentes moleculares na liberação das EETs em resposta ao A. fumigatus. Mostramos que a liberação das EETs envolve, além da isoforma PI3Kδ, a isoforma PI3Kγ e que a polimerização dos filamentos de actina e dos microtúbulos, bem como a atividade da miosina II não muscular (MIINM), são necessárias para a formação das EETs. Por outro lado, observamos que a formação de poros pela gasdermina-D, observada na liberação de redes extracelulares de DNA induzida por PMA em neutrófilos, não parece ser necessária para a liberação das EETs em resposta ao A. fumigatus, sugerindo uma distinção entre esses dois processos. Por fim, mostramos que a liberação das EETs em resposta a fungos não se restringe ao A. fumigatus, pois observamos que diferentes cepas de Candida albicans também induzem esse processo, com a distinção de que em resposta à C. albicans a liberação das EETs ocorre de forma dependente da presença de soro humano. Portanto, a liberação das EETs por eosinófilos humanos parece ser um mecanismo conservado de resposta dos eosinófilos aos fungos que pode contribuir para a gravidade das MBPAs e ser alvo de novas estratégias terapêuticas.
Palavras-chave:
redes extracelulares de DNA;eosinófilos;fungos;micoses broncopulmonares alérgicas
Abstract
Allergic bronchopulmonary mycoses (ABPM) are a group of eosinophilic diseases caused by hypersensitivity to filamentous fungi that affects asthmatic adults and cystic fibrosis children. Eosinophil extracellular traps (EETs) contribute to airways obstruction by increasing secretion viscosity and by interacting with epithelial and neuroendocrinal cells, leading to aggravation of those pathologies. Our group showed in previous studies that human eosinophils release EETs in response to Aspergillus fumigatus, the major species involved in ABPMs. This process occurs independently of reactive oxygen species and dectin-1, but depends on the integrin CD11b/CD18, calcium and several kinases: Src, Syk, p38-MAPK, PI3Kδ and AKT. Here we investigate the contribution of other molecular components in the release of A. fumigatus induced EETs. We show the involvement of PI3Kγ, besides PI3Kδ, and the need for cytoskeleton dynamics to EET release. Particularly, inhibition of actin filaments and microtubule polymerization, and the inhibition of non-muscle myosin II both impaired EET formation. Gasdermin-D (GSDMD) forms pores in membranes and has been suggested to be involved in PMA-induced formation of neutrophil extracellular traps. However, here we show that eosinophils pre-treated with LDC7559, a small molecule able to inhibit GSDMD activity, were still able to release A. fumigatus induced EETs. Therefore, it is possible that GSDMD does not play a role in this process. Finally, we show that two Candida albicans strains are also capable of inducing EET release, but this process occurs only in presence of human serum. Therefore, the release of EETs by human eosinophils seems to be a conserved mechanism towards fungal species that contributes to severity of ABPMs and thus might be a target for new therapeutics.
Keywords:
DNA extracellular traps;eosinophils;fungi;allergic bronchopulmonary mycoses
Marcadores Imunológicos de Resistência e Tolerância à Doença: Caracterização de NRF2 como Alvo Terapêutico na COVID-19
Título: Marcadores Imunológicos de Resistência e Tolerância à Doença: Caracterização de NRF2 como Alvo Terapêutico na COVID-19
Aluno: HEINY DELCIENE DE PINA FERNANDES
Orientador(es): MARCELO TORRES BOZZA
Resumo
A doença do coronavírus 2019 (COVID-19) causada pelo vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus 2 (SARS-CoV-2) é caracterizada por uma gama de manifestações clínicas que vai desde indivíduos assintomáticos à indivíduos com sintomas graves que podem levar ao óbito. Mesmo com os diversos estudos publicados sobre a COVID-19, ainda não estão claros os mecanismos imunológicos envolvidos nos diferentes desfechos da doença. A resistência e tolerância são mecanismos pelos quais o hospedeiro pode lidar com uma carga do patógeno. Resistência representa a capacidade do hospedeiro de limitar a carga infecciosa, tolerância à doença significa a capacidade do hospedeiro de limitar o dano provocado pelo patógeno. A infecção pelo SARS-CoV-2 pode induzir a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) causando estresse oxidativo e danos teciduais. ROS em associação com a produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias parecem contribuir para um pior prognóstico na COVID-19. Um dos mecanismos que regulam a resposta ao estresse oxidativo é mediado pela NRF2 que também pode interferir nas vias de sinalização do NF-κB e reprimir genes próinflamatórios como TNF e IL-6. A heme-oxigenase-1 (HO-1) é induzida em resposta ao estresse oxidativo via fator nuclear derivado de eritróide 2 (NRF2), tendo efeitos regulatórios na inflamação. Neste contexto, a hipótese deste trabalho é que existem marcadores imunológicos que determinam de forma precoce os diferentes desfechos observados durante a infecção pelo SARS-CoV-2. E ainda, que os antioxidantes podem ser capazes de reduzir a resposta inflamatória causada pelo SARS-CoV-2 através da regulação positiva do NRF-2. O objetivo deste trabalho foi determinar os indicadores precoces de resistência e tolerância à doença na COVID-19, e investigar a contribuição de antioxidantes na resposta inflamatória e no estresse oxidativo induzidos pelo SARS-CoV2. Análises comparativas foram realizadas em PBMCs e plasma de pacientes com quadros graves (Graves), definidos pela necessidade de suporte de oxigênio e hospitalização; pacientes com persistência viral (Pers) são os pacientes que permaneceram RT-qPCR positivo mais de 21 dias após início dos sintomas (DASO); pacientes com quadro brando (Covid) são os indivíduos que negativaram até os 21 DASO; e os voluntários não infectados (NI). Dentre os resultados, identificamos que pacientes com persistência viral têm baixa produção de IFN-I e alta expressão de KEAP-1 quando comparados com pacientes com quadros brandos de COVID-19 e pacientes com quadros graves. É possível que esses resultados justifiquem a baixa resistência dos pacientes com persistência viral. Além disso, vimos que os pacientes com quadros graves têm elevada produção de TNF, NRF2 e seus genes alvos como TXNDR1 e HO-1, quando comparados aos pacientes com persistência viral e Covid. Vimos a capacidade do SARS-CoV-2 infectar a linhagem monocítica THP-1, induzir a produção de citocinas inflamatórias estresse oxidativo nos primeiros dias após a infecção. Além disso, observamos que o ix SARS-CoV-2 inativado induziu fortemente ROS nas THP-1, que foi inibido com o uso de resveratrol, um antioxidante indutor de NRF2. Células THP-1 pré-tratadas com resveratrol ou curcumina e estimuladas com vírus inativado ou R848 demonstraram aumento na expressão de NRF2 e HO-1 e redução na secreção de TNF e IL-6. Esses resultados sugerem que o resveratrol e a curcumina podem ser uma estratégia para prevenir ou tratar a infecção grave por SARS-CoV-2 e outros vírus respiratórios, porém mais investigações são necessárias para introduzir esses antioxidantes como alvo farmacêutico para COVID19. Palavras-Chaves: SARS-CoV-2; resistência; tolerância à doença; resveratrol; curcumina; NRF2; TNF; IL-6
Palavras-chave:
SARS-CoV-2;resistência;tolerância à doença;resveratrol;curcumina;NRF2;TNF;IL-6
Abstract
Coronavirus disease 2019 (COVID-19) caused by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus is characterized by a series of clinical manifestations anging from asymptomatic individuals to individuals with severe symptoms that can lead to death. Even with the various studies published on COVID-19, the immunological mechanisms involved in the different outcomes of the disease are still unclear. Resistance and tolerance are mechanisms by which the host can cope with pathogen load. Resistance represents the host’s ability to limit the infectious load, disease tolerance means the host’s ability to limit the damage caused by the pathogen. SARS-CoV-2 infection can induce excessive production of reactive oxygen species (ROS) causing oxidative stress and tissue damage. ROS in association with the exacerbated production of pro-inflammatory cytokines appears to contribute to a worse prognosis in COVID-19. One of the mechanisms that regulate the response to oxidative stress is mediated by NRF2, which can also interfere with NF-κB signaling pathways and repress pro-inflammatory genes such as TNF and IL-6. Heme-oxygenase-1 (HO-1) is induced in response to oxidative stress via NRF2, having regulatory effects on inflammation. In this context, the hypothesis of this work is that there are immunological markers that determine early the different outcomes observed during SARS-CoV-2 infection. Furthermore, antioxidants may be able to reduce the inflammatory response caused by SARS-CoV-2 through the positive regulation of NRF2. The objective of this work as to determine the early indicators of disease resistance and tolerance in COVID-19, and to investigate the contribution of antioxidants to the inflammatory response and oxidative stress induced by SARS-CoV-2. Comparative analyzes were performed on PBMCs and plasma from patients with severe conditions (Severe), defined by the need for oxygen support and hospitalization; patients with viral persistence (Pers), are patients who remained RT-qPCR positive more than 21 days after the onset of symptoms (DASO); patients with a mild condition (Covid.C), are individuals who tested negative up to 21 DASO; and uninfected volunteers (NI). Among the results, we identified that patients with viral persistence have low production of IFN-I and high expression of KEAP-1 when compared to patients with mild COVID-19 and patients with severe conditions. It is possible that these results justify the low resistance of patients with viral persistence. Furthermore, we saw that patients with severe conditions have elevated production of TNF, NRF2 and their target genes such as TXNDR1 and HO-1, when compared to patients with viral persistence and Covid. We saw the ability of SARS-CoV-2 to infect the THP-1 monocytic lineage, induce the production of inflammatory cytokines and oxidative stress in the first days after infection. Furthermore, we observed that inactivated SARS-CoV-2 strongly induced ROS in THP-1, which was inhibited with the use of resveratrol, an NRF2-inducing antioxidant. THP-1 cells pretreated with resveratrol or curcumin and stimulated with inactivated virus or R848 demonstrated increased expression of NRF2 and HO-1 and reduced secretion of TNF and IL-6. These results suggest that xi resveratrol and curcumin may be a strategy to prevent or treat severe infection with SARSCoV-2 and other respiratory viruses, but further investigation is needed to introduce these antioxidants as a pharmaceutical target for COVID-19. Keywords: SARS-CoV-2; resistance; disease tolerance; resveratrol; curcumin; NRF2; TNF; IL-6
Keywords:
SARS-CoV-2;resistance;disease tolerance;resveratrol;curcumin;NRF2;TNF;IL-6
Mecanismos Envolvidos no Reconhecimento de 'L. monocytogenes' pelo Maquinário Autofágico
Título: Mecanismos Envolvidos no Reconhecimento de ‘L. monocytogenes’ pelo Maquinário Autofágico
Aluno: THALITA SANTOS DE MORAES DE FARIAS
Orientador(es): LEONARDO HOLANDA TRAVASSOS CORREA
Resumo
Autofagia consiste em um processo homeostático altamente conservado que direciona, por meio de adaptadores autofágicos, constituintes celulares disfuncionais e patógenos presentes no compartimento intracelular para a via de degradação lisossomal. Em mamíferos, esse processo é regulado inicialmente pelo complexo ULK, que pode ser inibido diretamente pelo complexo mTORC1. Sinais upstream à ULK e mTORC1, como por exemplo a privação de aminoácidos e a presença de patógenos intracelulares, são suficientes para estimular a maquinaria autofágica. Nesse último caso, a autofagia, denominada especificamente como xenofagia, atua como um importante braço efetor do sistema imune inato, contribuindo para a eliminação do patógeno. Embora a forma como os adaptadores autofágicos reconhecem patógenos intracelulares seja bem descrita na literatura, pouco se sabe a respeito dos requerimentos necessários para tal reconhecimento. Por esse motivo, procuramos investigar os mecanismos envolvidos no reconhecimento de bactérias intracelulares por p62, adaptador autofágico melhor caracterizado até então, utilizando como modelo de patógeno L. monocytogenes. Para isso, infectamos MEFs (do inglês, mouse embryonic fibroblasts) selvagens, nocautes para p62 e transduzidos com retrovírus expressando a forma selvagem ou com uma mutação sítio dirigida em S409 (S409A), além de MEFs nocautes para ULK1 e analisamos etapas essenciais para a xenofagia da bactéria: a ubiquitinação e a associação com p62. Nossos resultados mostraram que L. monocytogenes é reconhecida por p62 no citosol de MEFs e internalizada em autofagossomos já em 2h após a infecção. Pela primeira vez, demonstramos que a fosforilação do domínio UBA de p62 em S409 interfere diretamente no reconhecimento por p62 e na eliminação de L. monocytogenes e que ULK1 tem participação fundamental durante esse processo. Palavras-chave: L. monocytogenes; xenofagia; p62; ULK1
Abstract
Autophagy consists of a highly conserved homeostatic process that directs, through autophagic adapters, dysfunctional cellular constituents and pathogens present in the intracellular compartment to the lysosomal degradation pathway. In mammals, this process is initially regulated by the ULK complex, which can be directly inhibited by the mTORC1 complex. Signals upstream to ULK and mTORC1, such as amino acid deprivation and the presence of intracellular pathogens, are sufficient to stimulate the autophagic machinery. In the latter case, autophagy, specifically called xenophagy, acts as an important effector arm of the innate immune system, contributing to pathogen elimination. Although the way in which autophagic adapters recognize intracellular pathogens is well described in the literature, little is known about the requirements for such recognition. For this reason, we sought to investigate the mechanisms involved in the recognition of intracellular bacteria by p62, the best characterized autophagic adapter so far, using L. monocytogenes as a pathogen model. To this end, we infected wild-type MEFs (mouse embryonic fibroblasts), p62 knockouts and transduced with retroviruses expressing the wild-type form or with a site-directed mutation in S409 (S409A), in addition to ULK1 knockout MEFs, and analyzed essential steps for the bacterial xenophagy: ubiquitination and association with p62. Our results showed that L. monocytogenes is recognized by p62 in the cytosol of MEFs and internalized into autophagosomes as early as 2 h after infection. For the first time, we demonstrate that phosphorylation of the UBA domain of p62 at S409 directly interferes with p62 recognition and elimination of L. monocytogenes and that ULK1 plays a fundamental role during this process. Keywords: L. monocytogenes; xenophagy; p62; ULK1
Keywords:
monocytogenes;xenophagy;p62;ULK1
O Receptor Axl Controla o Recrutamento de Células do Sistema Imunitário Inato nas Vias Aéreas Durante a Pneumonia por "Streptococcus Pneumoniae"
Título: O Receptor Axl Controla o Recrutamento de Células do Sistema Imunitário Inato nas Vias Aéreas Durante a Pneumonia por “Streptococcus Pneumoniae”
Aluno: ESTER PALERMO MAIA
Orientador(es): ALESSANDRA D ALMEIDA FILARDY
Resumo
MAIA, Ester Palermo. O receptor Axl controla o recrutamento de células do sistema imunitário inato durante a pneumonia por Streptococcus pneumoniae. Rio de Janeiro, 2023. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Inflamação) – Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. A mucosa pulmonar é um microambiente dinâmico, exposto ao meio exterior. Macrófagos alveolares (AMs) são fundamentais no estabelecimento da homeostase pulmonar e na defesa contra infecções bacterianas. As pneumonias adquiridas na comunidade são as mais comuns e causam alta mortalidade, sendo frequentemente causadas por Streptococcus pneumoniae. A pneumonia é indutora de intensa inflamação nos lóbulos pulmonares, que precisa ser controlada para não causar prejuízo à função dos pulmões. Os AMs são células importantes na fagocitose e eliminação de microrganismos nos pulmões, além de recrutar outras células do sistema imunitário por meio da secreção de citocinas e quimiocinas. Além de seu papel na imunidade, os AMs também são responsáveis por fagocitar células apoptóticas (eferocitose) e por manter a tolerância aantígenos inócuos. Os receptores de eferocitose da família TAM (Tyro3, Axl e MerTk), expressos por fagócitos reconhecem fosfatidilserina (PtdSer) nas células apoptóticas através das moléculas-pontes Gas6 e proteína S. Além de mediarem a eferocitose, os receptores TAM inibem as vias pró-inflamatórias dos receptores do tipo Toll (TLRs) e de citocinas. A geração de células apoptóticas durante a pneumonia torna a eferocitose essencial para regulação e tolerância do tecido aos danos, sendo assim decidimos por caracterizar o papel dos receptores TAM durante a pneumonia por S. pneumoniae. Nossos resultados in vitro mostraram que a infecção por S. pneumoniae induziu a apoptose e necrose de AMs. Verificamos que a infecção pulmonar causou diminuição do peso corporal, independente da ausência de receptores TAM. Também mostramos que as populações de AMs residentes (ResAMs) e AMs derivados de monócitos (MonAMs) são drasticamente diminuídas durante a pneumonia pneumocócica; e que o receptor Axl teve um papel protetor na manutenção parcial destas populações de AMs. Além disso, mostramos um menor número de neutrófilos nos fluidos dos lavados broncoalveolares (BALs) de camundongos Axl-/- infectados, comparados aos selvagens e MerTk-/- , o que não afetou a liberação de redes extracelulares de neutrófilos (NETs) dessas células. No tempo avaliado, não observamos diferença na produção das citocinas TNF-a e IL-1b entre os animais selvagens e nocautes infectados. Em síntese, nossos dados sugerem que a expressão de Axl está relacionada a um microambiente que aumenta o recrutamento de leucócitos, o que pode causar danos aos tecidos. Sendo assim, terapias que possam ser desenhadas para o enfrentamento da pneumonia por S. pneumoniae devem levar em consideração esse potencial papel diferencial de MerTk e Axl em AMs.
Palavras-chave: eferocitose; Macrófagos alveolares; receptores TAM; Streptococcus pneumoniae
Abstract
MAIA, Ester Palermo. Axl receptor controls the recruitment of innate immune cells during Streptococcus pneumoniae pneumonia Rio de Janeiro, 2023. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Inflamação) – Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. The lung mucosae is a dynamic microenvironment exposed to the external surfaces. Alveolar macrophages (AMs) are crucial in the establishment of pulmonary homeostasis and defense against bacterial infections. Community-acquired pneumonia is the most common type with high mortality rates, frequently caused by Streptococcus pneumoniae. S. pneumoniae infection induces intense inflammation in the pulmonary lobes, which needs to be controlled to avoid impairment of the lung function. AMs are important cellsfor phagocytosis and the death of microorganisms in the lungs while recruiting other immune cells by the secretion of cytokines and chemokines. In addition to their role in immunity, AMs are responsible for the phagocytosis of apoptotic cells (efferocytosis) and the maintenance of tolerance to innocuous antigens. The TAM family receptors (Tyro3, Axl, and MerTk) are expressed by phagocytes and indirectly recognize phosphatidylserine (PtdSer) in apoptotic cells by Gas6 and protein S bridging molecules. Besides efferocytosis, TAM receptors block pro-inflammatory Toll-like (TLRs) and cytokines receptor pathway. Many apoptotic cells are generated during lung infection and, for this reason, TAM receptor-mediated efferocytosis in AMs might have an impact on the exacerbation of bacterial pneumonia. The outstanding number of cells turning apoptotic during pneumonia highlights the essential role of efferocytosis in regulation and tissue tolerance to damage. Therefore, we have decided to characterize the role of TAM receptors during S. pneumoniae pneumonia. Our in vitro results demonstrated that S. pneumoniae infection is associated with AMs apoptosis and necrosis. We verified that lung infection decreases the body weight, regardless of the absence of TAM receptors. Our results also showed that resident AMs (ResAMs) and monocyte-derived AMs (MonAMs) are drastically reduced during pneumococcal pneumonia; and that Axl receptors have a protective role in maintaining these AMs populations. Furthermore, we showed a smaller number of neutrophils in Axl-/- infected mice, compared to wild type and MerTk-/- , which didn’t compromise the neutrophils extracellular traps (NETs) released from this population. During the infection period evaluated in this work, we didn’t observe differences in cytokine production, TNF-α, and IL-1β, comparing wild types and knockouts infected. Collectively, our data implie that Axl expression is related to an environment that increases leucocyte recruitment, which may cause damage to the tissue. Therefore, therapies for S. pneumoniae pneumonia should be designed taking into consideration the differential role of MerTk and Axl in AMs. Keywords: efferocytosis; Alveolar Macrophages; TAM receptors; Streptococcus pneumoniae
Keywords:
Efferocytosis;Alveolar Macrophages;TAM receptors;Streptococcus pneumoniae
Papel dos Receptores FCγs durante a Resposta Desencadeada pelo SARS-COV-2 em Monócitos
Título: Papel dos Receptores FCγs durante a Resposta Desencadeada pelo SARS-COV-2 em Monócitos
Aluno: CLARICE DE SOUZA CONSTANCIO
Orientador(es): JULIANA ECHEVARRIA NEVES DE LIMA
Resumo
O SARS-CoV-2 é o agente etiológico da doença de coronavírus 2019 (COVID-19), deprogressão altamente variável, desde leve até levando a óbito. A doença grave está associada a respostas prolongadas e exacerbadas de citocinas/quimiocinas em alguns indivíduos infectados, conhecida como “síndrome da tempestade de citocinas”, na qual as interleucinas (ILs), como IL-1β e a IL-6, TNF-α e IP10 encontram-se elevadas no plasma de indivíduos infectados. As citocinas podem estimular a migração de células imunes, como os monócitos do sangue periférico, que migram para os pulmões durante a doença. Essas células são classificadas em três subpopulações: monócitos clássicos (CD14++CD16neg), intermediários (CD14++CD16+) e não clássicos (CD14+CD16++), e podem estar alteradas em pacientes infectados. A infecção promove também uma robusta resposta humoral, resultando na produção de anticorpos contra SARS-CoV-2, que podem neutralizar partículas virais, ou desencadear a modulação da resposta celular via receptores da porção Fc das imunoglobulinas (FcR). Os receptores Fc presentes na superfície de células do sistema imunitário apresentam funções ativadoras ou inibitórias. Assim, o objetivo do trabalho foi estudar monócitos provenientes de sangue periférico de indivíduos com COVID-19, caracterizar a expressão de FcRs e avaliar a sua função na resposta ao SARS-CoV-2. Foi observado que há ligação da proteína S a monócitos de indivíduos infectados ou convalescentes para o SARS-CoV-2. Essa ligação entre os monócitos clássicos e a proteína S viral ocorre, pelo menos em parte, via imunoglobulinas. Além disso, nos monócitos clássicos houve uma redução significativa da expressão do FcRγ 1A (CD64) entre 15-25 dias após início dos sintomas (DSSO), quando comparado entre 2-14 DSSO. Tanto os monócitos clássicos quanto os intermediários apresentaram uma diminuição na frequência de células que expressavam FcRα (CD89) após 100 DSSO. A interação entre imunoglobulinas e a proteína viral S foi confirmada utilizando células da linhagem monocítica THP-1. Em conjunto os resultados sugerem que os níveis de FcγR e FcαR foram modulados em monócitos durante a fase aguda e convalescente do COVID-19, podendo alterar a ativação dos monócitos.
Abstract
SARS-CoV-2 virus is the etiological agent of coronavirus disease 2019 (COVID-19), of highly variable progression, from mild to leading to death. Severe disease is associated with prolonged and exacerbated cytokine/chemokine responses in some infected individuals, known as “cytokine storm syndrome”, in which interleukins (ILs) such as IL-1β and IL-6, TNF-α and IP10 are elevated in the plasma of infected individuals. Cytokines can stimulate the migration of immune cells, such as peripheral blood monocytes, which migrate to the lungs during the disease. These cells are classified into three subpopulations: classical (CD14++CD16neg), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocytes, and may be altered in infected patients. The infection promotes a robust humoral response, resulting in the production of antibodies against SARS-CoV-2, which can neutralize viral particles, or modulating the cellular response via receptors of the Fc portion of immunoglobulins (FcR). The FcRs present on the surface of immune cells have activating or inhibitory functions. Thus, the aim of this work was to study monocytes from the peripheral blood of individuals with COVID-19, to characterize the expression of FcRs and to evaluate their function in response of SARS-CoV-2. It has been observed that protein S binds to monocytes from infected or convalescent individuals for SARS-CoV-2. This binding between classical monocytes and viral S protein occurs, at least in part, via immunoglobulins, probably linked to FcRs. Furthermore, in classical monocytes, there was a significant reduction in FcRγ 1A (CD64) expression between 15-25 days since symptom onset (DSSO), when compared to 2-14 DSSO. Classical and intermediate monocytes showed a decrease in the frequency of cells expressing FcRα (CD89) after >100 DSSO. The interaction between immunoglobulins and viral protein S was confirmed using THP-1 monocytic lineage cells. Together, the results suggest that FcγR and FcαR levels were modulated in monocytes during the acute and convalescent phase of COVID-19, which may modulate monocyte activation.
Keywords:
COVID-19;SARS-CoV-2;Monocytes;Fcγ receptors;Immunoglobulin G
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