TESES
Mecanismos Envolvidos na Tolerância Oral Induzida pela Utilização da Bactéria Lactococcus Lactis em Combinação com o Antígeno
Título
Título: Mecanismos Envolvidos na Tolerância Oral Induzida pela Utilização da Bactéria Lactococcus Lactis em Combinação com o Antígeno
Aluno: PEDRO HENRIQUE OLIVEIRA VIANNA
Orientador(es): ADRIANA CESAR BONOMO
Resumo
VIANNA, Pedro Henrique Oliveira. MECANISMOS ENVOLVIDOS NA TOLERÂNCIA ORAL INDUZIDA PELA UTILIZAÇÃO DA BACTÉRIA Lactococcus lactis EM COMBINAÇÃO COM O ANTÍGENO. Rio de Janeiro, 2023. Tese (Doutorado em Imunologia e Inflamação) – Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. Tolerância oral é definida por um estado de hipo responsividade imunológica antígeno-específica, induzida por antígenos introduzidos via oral. É um mecanismo natural através do qual, não rejeitamos antígenos alimentares. É conhecido que alguns probióticos participam da modulação de respostas imunes em doenças inflamatórias. De fato, nosso grupo demonstrou previamente, este efeito modulador na doença enxerto contra hospedeiro (DECH), utilizando a Lactococcus lactis NCDO2118 em combinação com antígenos do hospedeiro. Com o objetivo de melhor compreender os mecanismos da terapia combinada, foi utilizado um modelo inflamatório de mais simples manejo, o modelo de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) na orelha de camundongos B6, utilizando a ovalbumina (OVA) como antígeno. Após a padronização do modelo, as doses subótima (0,1 mg/mL) e ótima (1 mg/mL) de OVA para indução da tolerância oral foram ajustadas. A dose subótima (não-tolerogênica) de OVA em combinação com o probiótico L. lactis foi capaz de induzir tolerância, confirmando o papel dessa bactéria como um adjuvante tolerogênico. Foi possível observar que o potencial tolerogênico da L. lactis independe do seu metabolismo ativo, uma vez que a administração de bactérias não viáveis (mortas por calor) também foi capaz de induzir tolerância a OVA no modelo de DTH. Além disso, constatamos que a resposta tolerante induzida pela terapia combinada é específica para o antígeno introduzido via oral, uma vez que animais tolerizados com OVA e desafiados com antígeno não relacionado KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), exibiram menor edema de orelha, sugerindo que os animais possuem modulação específica e não estado de imunossupressão. Em relação aos mecanismos celulares envolvidos na tolerância, podemos dizer que os linfócitos B CD43- com maior expressão de IL-10, são peças-chave para a geração inicial da tolerância, especialmente nos mLN. Alinhado com este dado, observamos também no grupo tolerizado um aumento de células T reguladoras no mLN, que podem contribuir para a geração da tolerância inicial no ambiente intestinal. Por outro lado, camundongos deficientes em células B ou na citocina IL-10, não geram proteção com a terapia combinada, sugerindo a dependência de linfócitos B e de IL-10. Fato comprovado pela transferência adotiva de células B tolerizadas de animais tolerizados para animais não tratados e em seguida submetidos a DTH. Nosso estudo pode abrir novas possibilidades para o desenvolvimento de estratégias de indução de tolerância antígeno específica tanto para transplante de órgãos quanto doenças alérgicas. Palavras chave: Lactococcus lactis; linfócitos T; linfócitos B; tolerância IL-10; imunológica; tolerância oral
Abstract
Oral tolerance is defined by a state of antigen specific immunological hiporesponsiveness induced by oral administration of an antigen. Some probiotic bacteria such as Lactobacilli and Lactococci were shown to diminish immune responses in inflammatory disease models. Our group showed, using an acute Graft-versus-host disease (aGVHD) model, that the combined oral administration of Lactococcus lactis NCDO2118 with host antigens to the graft donor inhibits aGVHD, the main intercurrence of allogeneic stem cell transplantation. In order to understand the mechanisms of this therapy, we chose to use a simpler model. Combined therapy protocol was then set in a delayed-type hypersensitivity (DTH) model to OVA. Initially, we standardized the DTH model to OVA and found the suboptimal and optimal doses of OVA for induction of oral tolerance. The administration of suboptimal non-tolerogenic dose of antigen in combination with L. lactis induced tolerance to OVA challenge in DTH response, confirming the role of L. lactis as a tolerogenic adjuvant. Adjuvant tolerogenic potential of L. lactis does not depends on secreted molecules or active metabolism since the administration of “heat-killed” bacteria was capable of induce tolerance to OVA in DTH response. Besides that, the oral-induced tolerance seems to be antigen- specific, since it was unable to protect mice from DTH induced by unrelated antigen. Regarding the cellular mechanisms involved in tolerance, we showed that CD43- B lymphocytes with high expression of IL-10, especially in mLN, are key elements for the initial generation of tolerance. In line with this data, we also observed in the tolerant group an increase in regulatory T cells in mLN, which may contribute to the intestinal tolerogenic environment. Moreover, combined therapy was unable to protect B-deficient and IL10-deficient mice from DTH, suggesting a B-dependent, IL10-dependent mechanism of tolerance, which in fact is confirmed with the adoptive transfer of tolerated B cells for untreated animals. We believe that our studies will open up new possibilities for the development of specific antigen tolerance strategies, for either organ transplantation or allergic diseases. Keywords: Lactococcus lactis; T lymphocytes; B lymphocytes; immune tolerance; oral tolerance; IL-10
Keywords:
Lactococcus lactis;T lymphocytes;B lymphocytes;immune tolerance;oral tolerance;IL-10
Modulação da Resposta ao IFN por Isolados Distintos do Vírus Zika e seu Papel na Replicação e Disseminação Viral para o Sistema Nervoso Central
Título
Título: Modulação da Resposta ao IFN por Isolados Distintos do Vírus Zika e seu Papel na Replicação e Disseminação Viral para o Sistema Nervoso Central
Aluno: YASMIN MUCUNA MUSTAFA
Orientador(es): LUCIANA BARROS DE ARRUDA
Resumo
MUSTAFÁ, Yasmin Mucunã. Modulação da resposta ao IFN por isolados distintos do vírus Zika e seu papel na replicação e disseminação do vírus para o sistema nervoso central. Rio de Janeiro, 2023. Tese (Doutorado em Imunologia e Inflamação), Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. A infecção pelo vírus Zika (ZIKV) está associada a manifestações neurológicas, incluindo microcefalia e meningoencefalite, e o vírus foi detectado nos tecidos e fluidos dos pacientes,sugerindo que ele atravessa a barreira hematoencefálica (BHE). Embora a ativação daresposta do interferon tipo I seja essencial para o controle do ZIKV, a replicação do vírus inibe essa resposta em alguns tipos de células humanas. Utilizando duas cepas de ZIKV: ZIKVMR766 e ZIKVPE243, nosso grupo demonstrou anteriormente que o ZIKV infecta células endoteliais de endotélio microvascular cerebral humano (HBMEC), in vitro, e atravessa a monocamada, sem afetar sua integridade. In vivo, nosso grupo e outros demonstraram que camundongos deficientes na expressão do receptor de interferons do tipo I (IFNAR-/-;linhagem SvA129), mas não seus controles selvagens (linhagem Sv129) eram susceptíveis a infecção por ZIKV após inoculação sistêmica, evidenciando a relevância da resposta do interferon na resistência a replicação viral. Nesse modelo (IFNAR-/-) demonstramos que a BHE foi impactada apenas em momentos tardios da infecção com camundongos infectados com ZIKVMR766, os quais sucumbiram a infecção. Por outro lado, não foi evidenciada perda de integridade da BHE após inoculação com ZIKVPE243 e os animais sobreviveram à infecção durante o período investigado. Embora a importância da resposta do interferon tipo I para o controle da infecção pelo ZIKV tenha sido demonstrada, o papel dessa resposta na integridade da BHE ainda não está claro. Aqui, investigamos se ZIKVPE243 e ZIKVMR766 interferiam na produção e resposta ao IFN tipo I após infecção de HBMEC, como modelo de BHE in vitro. Observamos que a infecção de HBMEC com ZIKVMR766 induziu uma produção maior e mais rápida de IFN-β, em conjunto com aumento da fosforilação de IRF-3, em comparação com a infecção com ZIKVPE243. A infecção com ambas as cepas de vírus inibiu significativamente a resposta mediada por IFN, como evidenciado pela célula luciferase/ISRE-reporter HBMEC (HBMEC pISREluc). Consequentemente, a adição de IFN-β às culturas não afetou a replicação do vírus nem a viabilidade celular, corroborando que o ZIKV escapa dessa resposta. A infecção com ZIKVMR766 resultou em uma inibição mais potente da resposta ao IFN, associada à degradação aumentada de STAT2 e maior inibição da fosforilação de STAT1. Por outro lado, quando as células foram tratadas com IFN-β antes da infecção com ZIKV, a ativação de ISRE foi induzida e uma diminuição na replicação viral foi detectada, sugerindo efeito de IFN em células bystander, não infectadas, presentes nas culturas. Ensaios in vivo utilizando modelo de inoculação intracerebral em camundongos SvA129, demonstraram que a infecção com ZIKVMR766 leva a maior replicação viral no cérebro, em comparação com ZIKVPE243. Os animais infectados com ZIKVMR766, mas não com ZIKVPE243, desenvolveram manifestações neurológicas e sucumbiram a infecção. Por outro lado, a infecção de camundongos selvagens SV129 com ambas as cepas não induziu sinais neurológicos nem levou à morte dos animais, no período analisado. A replicação de ZIKVPE243 nesse modelo foi muito inferior àquela detectada nos animais SvA129, evidenciando o papel protetor de IFN contra a replicação viral. Após a infecção com ZIKVMR766, no entanto, observamos carga viral muito semelhante a detectada em animais SvA129, corroborando sua maior capacidade dessa cepa de escapar da resposta mediada por IFN. Surpreendentemente, apesar da alta carga viral no cérebro, os animais sobreviveram a infecção, pelo menos durante o período avaliado, sugerindo um papel de IFNs do tipo I na proteção contra a neuropatologia por mecanismos independentes do controle da replicação viral. Esses dados sugerem um papel dessas citocinas xiv na resistência e tolerância a infecção por ZIKV, por mecanismos que serão futuramente investigados. Palavras-chave: Vírus Zika; HBMEC; BHE; IFN-β; SNC; Resposta ao IFN
Palavras-chave:
Vírus Zika;HBMEC;BHE;IFN-β;SNC;Resposta ao IFN
Abstract
MUSTAFÁ, Yasmin Mucunã. Modulation of the IFN response by distinct Zika virus isolates and their role in virus replication and spread to the central nervous system. Rio de Janeiro, 2023. Thesis (Ph.D. in Immunology and Inflammation), Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. Zika virus (ZIKV) infection is associated with neurological manifestations, including microcephaly and meningoencephalitis, and the virus has been detected in the tissues and fluids of patients, suggesting its ability to cross the blood-brain barrier (BBB). While the activation of type I interferon response is essential for ZIKV control, the virus can inhibit this response in certain types of human cells. In our previous work using two ZIKV strains, ZIKVMR766 and ZIKVPE243, we demonstrated that ZIKV infects human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) in vitro and crosses the monolayer without affecting its integrity. In vivo, our group and others showed that mice deficient in type I interferon receptor expression (IFNAR-/-; SvA129 strain), but not their wild-type controls (Sv129 strain), were susceptible to ZIKV infection following systemic inoculation, highlighting the relevance of the interferon response in viral replication resistance. In this IFNAR-/- model, we found that the BBB was impacted only at the late stages of infection in mice infected with ZIKVMR766, which led to their demise. On the other hand, no loss of BBB integrity was observed after inoculation with ZIKVPE243, and the animals survived the infection during the investigated period. Although the importance of type I interferon response in controlling ZIKV infection has been demonstrated, the role of this response in BBB integrity remains unclear. Here, we investigated whether ZIKVPE243 and ZIKVMR766 interfere with the production and response to type I interferon following HBMEC infection, serving as an in vitro BBB model. We observed that HBMEC infection with ZIKVMR766 induced higher and faster production of IFN-β, along with increased phosphorylation of IRF-3, compared to infection with ZIKVPE243. Both virus strains significantly inhibited the IFN-mediated response, as evidenced by luciferase/ISRE reporter HBMECs (HBMEC pISREluc). Furthermore, the addition of IFN-β to the cultures did not affect virus replication or cell viability, confirming that ZIKV evades this response. ZIKVMR766 infection resulted in a more potent inhibition of the IFN response, associated with increased STAT2 degradation and greater inhibition of STAT1 phosphorylation. Conversely, when cells were treated with IFN-β prior to ZIKV infection, ISRE activation was induced, and a decrease in viral replication was detected, suggesting the effect of IFN on the bystander, non-infected cells present in the cultures. In vivo, assays using an intracerebral inoculation model in SvA129 mice demonstrated that ZIKVMR766 infection led to higher viral replication in the brain compared to ZIKVPE243. Animals infected with ZIKVMR766, but not with ZIKVPE243, developed neurological manifestations and succumbed to the infection. Conversely, infection of wild-type SV129 mice with both strains did not induce neurological signs or lead to animal death during the analyzed period. ZIKV replication in this model was significantly lower for ZIKVPE243 compared to SvA129 animals, highlighting the protective role of IFN against viral replication. However, even with a high viral load in the brain, animals survived the infection, at least during the evaluated time period, suggesting a role for type I IFNs in protection against neuropathology through mechanisms independent of viral replication control. These data suggest a role for these cytokines in resistance and tolerance to ZIKV infection, which will be further investigated in future studies. Keywords: Zika Virus; HBMEC; BBB; IFN-β; CNS; IFN response
Keywords:
Zika Virus;HBMEC;BBB;IFN-β;CNS;IFN response
O Papel do Inflamossomo na Modulação da Resposta Inflamatória em um Modelo de Asma Experimental Causada pela Exposição Crônica ao "Aspergillus Fumigatus"
Título
Título: O Papel do Inflamossomo na Modulação da Resposta Inflamatória em um Modelo de Asma Experimental Causada pela Exposição Crônica ao “Aspergillus Fumigatus”
Aluno: MARCELLA ALMEIDA AZEVEDO DETONI
Orientador(es): RODRIGO TINOCO FIGUEIREDO
Resumo
A asma é uma doença heterogênea caracterizada pela inflamação crônica das vias aéreas inferiores. Uma associação entre a exposição aos fungos, em particular ao Aspergillus fumigatus, e a asma é reconhecida clinicamente e epidemiologicamente. As células do hospedeiro expressam receptores de reconhecimento de padrão citoplasmáticos capazes de desencadear a montagem dos inflamossomos, que são complexos de sinalização molecular que controlam a ativação de caspases inflamatórias. O inflamossomo NLRP3 é o principal inflamossomo de reconhecimento de fungos e têm sido implicado no desenvolvimento de asma, no entanto, o seu papel em diferentes modelos de inflamação alérgica pulmonar é controverso. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do inflamossomo na modulação da resposta inflamatória na inflamação alérgica pulmonar induzida pela exposição crônica ao A. fumigatus. Nossos resultados mostram que os camundongos Casp1-/-Casp11Sv129def apresentam infiltrado inflamatório, eosinofilia, produção de muco e hiper-reatividade das vias aéreas aumentados em comparação aos camundongos selvagens após o desafio com A. fumigatus. Dessa maneira, os camundongos Casp1-/-Casp11Sv129def desafiados com o fungo apresentaram maior inflamação alérgica pulmonar comparados aos selvagens também desafiados com o fungo, sugerindo um papel regulador negativo de caspase-1 e/ou caspase-11. Já os camundongos Nlrp3-/- apresentaram infiltrado inflamatório, eosinofilia, produção de muco e hiper-reatividade das vias aéreas similares aos camundongos selvagens após o desafio com A. fumigatus. Do mesmo modo, os camundongos Il1r1-/- desafiados com A. fumigatus apresentaram eosinofilia e hiper-reatividade das vias aéreas similares aos selvagens desafiados com o fungo. De modo geral, ao investigarmos IL-4, IL-13, IL-5, IL-17 e IFN-γ no fluido do lavado broncoalveolar e no homogenato do pulmão não observamos diferença nos níveis dessas citocinas entre os camundongos desafiados com o fungo e os desafiados com PBS. Da mesma maneira não observamos diferenças significativas nos níveis dessas citocinas no sobrenadante das células do pulmão digerido após o re-estímulo com A. fumigatus. Ao investigarmos a carga fúngica pulmonar observamos diferenças significativas nos números de CFU apenas nos camundongos Casp1-/-Casp11Sv129def desafiados com A. fumigatus. Portanto, em conjunto, os nossos resultados indicam um papel da caspase-1 e/ou caspase-11 na inflamação alérgica pulmonar por mecanismos distintos da ativação do inflamossomo NLRP3 e da ação das citocinas IL-1α/β. Palavras-chave: asma; inflamossomo; fungo; caspase-1; NLRP3; Aspergillus fumigatus
Abstract
Asthma is a heterogeneous disease characterized by lower airway chronic inflammation. An association between exposure to fungi, in particular Aspergillus fumigatus, and asthma is clinically and epidemiologically recognized. Host cells express cytoplasmic pattern recognition receptors capable of triggering the assembly of inflammasome, which are molecular signaling complexes that control the activation of inflammatory caspases. The NLRP3 inflammasome is the main recognition inflammasome of fungi and has been implicated in the development of asthma, however its role in different models of allergic airway inflammation is controversial. Thus, the aim of this work was to evaluate the role of the inflammasome in the modulation of inflammatory response in allergic airway inflammation induced by chronic exposure to A. fumigatus. Our results show that Casp1-/-Casp11Sv129def mice show increased inflammatory infiltrate, eosinophilia, mucus production and airway hyperresponsiveness after A. fumigatus challenge when compared to wild type mice. Thus, Casp1-/-Casp11Sv129def mice challenged with A. fumigatus showed greater allergic airway inflammation compared to wild type mice also challenged with A. fumigatus, suggesting a negative regulatory role for caspase-1 and/or caspase-11. Nlrp3-/- mice showed inflammatory infiltrate, eosinophilia, mucus production and airway hyperresponsiveness similar to wild type mice after A. fumigatus challenge. Similarly, Il1r1-/-mice challenged with A. fumigatus showed eosinophilia and airway hyperresponsiveness similar to wild type mice challenged with A. fumigatus. In general, when we investigated IL-4, IL-13, IL-5, IL-17 and IFN-γ in bronchoalveolar lavage fluid and lung homogenate, we did not observe differences in the levels of these cytokines between mice challenged with A. fumigatus and those challenged with PBS. Likewise, we did not observe significant differences in the levels of these cytokines in the supernatant of digested lung cells after re-stimulation with A. fumigatus. When investigating lung fungal burden, we observed significant differences in CFU numbers only in Casp1-/-Casp11Sv129def mice challenged with A. fumigatus. Therefore, taken together, our results indicate a role for Caspase-1 and/or 11 in pulmonary allergic inflammation by mechanisms other than activation of the NLRP3 inflammasome and the action of the cytokines IL-1α/β. Keywords: asthma; inflammassome; fungus; caspase-1; NLRP3; Aspergillus fumigatus
Keywords:
asthma;inflammassome;fungus;caspase-1;NLRP3;Aspergillus fumigatus
O Papel do Modulador Epigenético CBX4 na Diferenciação de Linfócitos T CD8+
Título
Título: O Papel do Modulador Epigenético CBX4 na Diferenciação de Linfócitos T CD8+
Aluno: GUILHERME AFONSO MELO
Orientador(es): RENATA DE MEIRELLES SANTOS PEREIRA
Resumo
Melo, Gulherme Afonso. O PAPEL DO MODULADOR EPIGENÉTICO CBX4 NA DIFERENCIAÇÃO DE LINFÓCITOS T CD8. Rio de Janeiro, 2023. Doutorado em Imunologia e Inflamação, Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. As células T CD8+, componentes cruciais na resposta imune contra patógenos intracelulares e células tumorais, podem se diferenciar nos fenótipos efetor ou de memória, em respostas agudas, ou em células exaustas em respostas crônicas. Esse processo de diferenciação é controlado pela atuação coordenada de reguladores transcricionais e epigenéticos, os quais ainda estão sendo identificados e seus mecanismos moleculares de atuação descritos. Foi demonstrado que o complexo repressor Polycomb (PRC)2 possui papel central na diferenciação de células T CD8+ efetoras, no entanto, é desconhecido se o outro complexo da mesma família, PRC1, também participa desse processo. Neste estudo foi investigado o papel de PRC1, com um enfoque na subunidade Cbx4, na diferenciação de células T CD8+ em modelo de infecção murina viral aguda e crônica por LCMV ou em modelo de diferenciação in vitro. Nossos resultados mostraram que Cbx4 favorece a diferenciação de células T CD8+ para o fenótipo efetor, reprimindo o fenótipo e perfil transcricional de memória, e favorece a função efetora destas células, promovendo a expressão de citocinas pró-inflamatórias e atividade citotóxica. Ensaios de superexpressão de mutantes funcionais de Cbx4, revelaram que essas funções são dependentes primariamente dos motivos de interação com SUMO (SIM), responsáveis pela função E3 SUMO ligase da proteína, e em menor parte do cromodomínio de Cbx4, que conecta as atividades de PRC1 com PRC2. Além disso, foi visto que Cbx4 também participa do controle do ciclo celular e sobrevivência de células T CD8+, principalmente através de seu cromodomínio. Por fim, em resposta imune crônica, foi observado que Cbx4 também reprime o fenótipo de células T CD8+ exaustas precursoras, um subconjunto de células T CD8+ exaustas com maior capacidade multipotente e proliferativa. As evidências levantadas neste trabalho adicionam a proteína Cbx4 ao panorama de reguladores da diferenciação de células T CD8+, expandindo o conhecimento sobre os mecanismos moleculares deste processo, e indicam um possível alvo para a melhoria de estratégias terapêuticas.
Palavras-chave:
linfócitos T CD8+;epigenética;Polycomb;Cbx4;memória imunológica;exaustão de células T
Abstract
Melo, Gulherme Afonso. O PAPEL DO MODULADOR EPIGENÉTICO CBX4 NA DIFERENCIAÇÃO DE LINFÓCITOS T CD8+. Rio de Janeiro, 2023. Doutorado em Imunologia e Inflamação, Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2023. CD8+ T cells, crucial components in the immune response against intracellular pathogens and tumor cells, can differentiate into effector or memory phenotype cells, during acute responses, or exhausted cells during chronic responses. This differentiation process is controlled by the coordinated activity of transcriptional and epigenetic regulators, which are still being identified and having their molecular mechanisms described. It was demonstrated that Polycomb repressor complex (PRC)2 plays a central role in the effector CD8+ T cell differentiation, however, it is unknown whether the other Polycomb complex, PRC1, also participates in this process. In this study, the role of PRC1 in the CD8+ T cell differentiation process, with focus on the Cbx4 subunit, was investigated using murine LCMV acute and chronic viral infection models or in vitro differentiation models. Our results showed that Cbx4 favors effector CD8+ T cell differentiation, repressing memory phenotype and transcriptional profile, and favors CD8+ T cell effector function by promoting proinflammatory cytokine expression and cytotoxic activity. Overexpression of Cbx4 functional mutants revealed that those functions are mainly dependent on SUMO interaction motifs (SIM), responsible for SUMO E3 ligase function, while less dependent on Cbx4 chromodomain, which connects PRC1 and PRC2 activities. Besides, it was also observed that Cbx4 participates in cell cycle control and survival of CD8+ T cells, mainly through its chromodomain. Furthermore, in chronic immune response, Cbx4 also represses the exhausted precursor CD8+ T cell phenotype, a subset of exhausted CD8+ T cells with higher “stemness” and proliferative capacity. The evidence gathered here add Cbx4 to the panel of CD8+ T cell differentiation regulators, expanding the knowledge regarding the molecular mechanisms of this process and pointing out a possible target for the enhancement of therapeutic strategies.
Keywords:
CD8+ T lymphocytes;epigenetics;Polycomb;Cbx4;Immunologic memory;T cell exhaustion
Papel dos Receptores de Reconhecimento Padrão na Resposta Imune Inata no Modelo de Rabdomiólise em Camundongos
Título
Título: Papel dos Receptores de Reconhecimento Padrão na Resposta Imune Inata no Modelo de Rabdomiólise em Camundongos
Aluno: ANDREZA MOREIRA DOS SANTOS GAMA
Orientador(es): MARCELO TORRES BOZZA
Resumo
O sistema imune inato tem um papel central na manutenção da homeostase e na promoção da regeneração tecidual, sendo capaz de reconhecer PAMPs (do inglês: pathogen associated molecular patterns) e DAMPs (do inglês: damage-associated molecular pattern) através de PRRs (do inglês: pattern recognition receptors) e iniciar a resposta inflamatória. A exacerbação da inflamação pode promover dano tecidual e induzir sinais e sintomas, fazendo parte da patogênese de diversas doenças. A rabdomiólise é uma condição clínica caracterizada pela ruptura abrupta dos músculos esqueléticos, resultando na liberação de mioglobina para o meio extracelular e circulação, sendo esta descrita como a principal nefrotoxina envolvida na injúria renal aguda. Trata-se de uma proteína de aproximadamente 16 kDa, que contém uma molécula de heme, e é responsável pelo estoque e transporte de O2 nos músculos. O heme é um grupo prostético que exerce diversas funções biológicas, mas quando dissociado das hemeproteínas e livre, exerce efeitos pró-oxidantes, pró-inflamatórios e citotóxicos. O heme é capaz de ativar TLR4 de macrófagos e induzir a secreção de TNF, além de promover o processamento e a secreção de IL-1β através da ativação do inflamassoma de NLRP3. Sendo assim, a partir das premissas de que a mioglobina exerce papel patológico na rabdomiólise e que o heme atua nos mecanismos de ativação do sistema imune inato, a hipótese desse estudo é que o heme da mioglobina induz o dano renal associado à rabdomiólise através da ativação de receptores da imunidade inata. Nosso objetivo foi caracterizar o papel dos receptores da imunidade inata e a resposta inflamatória na lesão renal aguda em modelo experimental de rabdomiólise induzida por glicerol em camundongos. Nesse estudo, nós identificamos prejuízo na função renal e alterações histopatológicas do córtex renal após desafio com glicerol, que não dependem de uma possível transmigração bacteriana e liberação de PAMPs na circulação. Além disso, nós detectamos TNF no plasma 3 horas após o desafio com glicerol e expressão de IL- 1β nos rins 6 horas após o desafio. A sobrevida dos camundongos desafiados com glicerol é dependente de Tlr4, Myd88, Nlrp3, Asc e caspase-1. Porém, nossos dados indicam que a letalidade não depende dos mecanismos induzidos apenas por IL-1β ou pela ativação de TNFR1. Além disso, não observamos diferenças no infiltrado de macrófagos e neutrófilos nos rins de camundongos deficientes em Tlr4 e selvagens. No extrato de tecido renal de camundongos Tlr4 observamos a expressão de HO-1, indicando que o mecanismo de catabolismo intracelular do heme está ativado, porém não identificamos a expressão de megalina, uma proteína envolvida na reabsorção de mioglobina nos túbulos proximais renais. O tratamento com Dissulfiram, um inibidor de piroptose, não conferiu proteção. Esse conjunto de resultados sugerem que a ativação de receptores da imunidade inata exerce importante papel na patogênese rabdomiólise e que o heme seja o DAMP responsável por mediar essas ações, porém mais investigações são necessárias para definir os mecanismos pelos quais o heme impacta nesses eventos. Palavras-chave: Rabdomiólise; Mioglobina; Heme; TLR4; inflamossoma; Macrófagos; Espécies Reativas de Oxigênio.
Palavras-chave:
Rabdomiólise;Mioglobina;Heme;TLR4;inflamossoma;Macrófagos;Espécies Reativas de Oxigênio
Abstract
The innate immune system plays a central role in maintaining homeostasis and promoting tissue regeneration, capable of recognizing PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) and DAMPs (damage-associated molecular patterns) through PRRs (pattern recognition receptors) and initiating the inflammatory response. The exacerbation of inflammation can lead to tissue damage and induce signs and symptoms, contributing to the pathogenesis of various diseases. Rhabdomyolysis is a clinical condition characterized by the abrupt rupture of skeletal muscles, resulting in the release of myoglobin into the extracellular and circulatory space, which is described as the primary nephrotoxin involved in acute kidney injury. Myoglobin is a protein of approximately 16 kDa that contains a heme molecule and is responsible for storing and transporting oxygen in muscles. Heme is a prosthetic group that serves various biological functions, but when dissociated from heme proteins and free in the circulation, it exerts prooxidant, pro-inflammatory, and cytotoxic effects. Heme can activate TLR4 in macrophages, induce the secretion of TNF, and promote the processing and secretion of IL-1β through the activation of the NLRP3 inflammasome. Therefore, based on the premises that myoglobin plays a pathological role in rhabdomyolysis and that heme is involved in the mechanisms of innate immune system activation, the hypothesis of this study is that myoglobin’s heme induces renal damage associated with rhabdomyolysis through the activation of innate immune receptors. Our objective was to characterize the role of innate immune receptors and the inflammatory response in acute kidney injury in an experimental model of glycerol-induced rhabdomyolysis in mice. In this study, we identified impairment in renal function and histopathological changes in the renal cortex following glycerol challenge, which do not depend on possible bacterial transmigration and release of PAMPs into circulation. Additionally, we detected TNF in the plasma 3 hours after glycerol challenge and IL-1β expression in the kidneys 6 hours after the challenge. The survival of mice challenged with glycerol depends on Tlr4, Myd88, Nlrp3, Asc, and caspase-1. However, our data indicate that lethality does not depend solely on mechanisms induced by IL-1β or TNFR1 activation. Furthermore, we did not observe differences in macrophage and neutrophil infiltration in the kidneys of Tlr4-deficient and wild-type mice. In the renal tissue extract of Tlr4-deficient mice, we observed HO-1 expression, indicating that the intracellular heme catabolism mechanism is activated, but we did not identify megalin expression, a protein involved in myoglobin reabsorption in renal proximal tubules. Treatment with Disulfiram, a pyroptosis inhibitor, did not provide protection. This set of results suggests that the activation of innate immune receptors plays an important role in the pathogenesis of rhabdomyolysis, and heme may be the responsible DAMP mediating these actions. However, further investigations are needed to define the mechanisms by which heme impacts these events. Keywords: Rhabdomyolysis; Myoglobin; Heme; TLR4; Inflammasome; Macrophage; Reactive Oxygen Specie
Keywords:
Rhabdomyolysis;Myoglobin;Heme;TLR4;Inflammasome;Macrophage;Reactive Oxygen Specie
Siga nosso perfil no Instagram
Links Úteis
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde – Bloco D (sala D1-029) Cidade Universitária – Ilha do Fundão
CEP 21.941-590 – Rio de Janeiro – RJ – Telefone: (21) 3938-6748 – E-mail: pos_imuno@micro.ufrj.br
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde – Bloco D (sala D1-029) Cidade Universitária – Ilha do Fundão
CEP 21.941-590 – Rio de Janeiro – RJ
Telefone: (21) 3938-6748
E-mail: pos_imuno@micro.ufrj.br
